2结果

    2.1重组质粒的构建和鉴定 PCR产物片段约300bp,大小约为目的基因及信号态基因之和。经测序和读码框校读为Kringle5基因，（图1）为构建好pSNAV-Kringle5 用KpnI和XbaI双酶切，300bp余片段。腺伴随病毒包装滴度为2.5×1015 v.g/L，滴度和纯度均达到实验要求。选用感染复数MOI=50，rAAV-Kringle5 -gfp,腺相关病毒感染血管内皮细胞：48h荧光显微镜下观察绿色荧光表达，荧光显微镜下可见所有细胞都有表达且高表达,感染率达100%(图2)。

    图 1 构建好pSNAV-Kringle5用KpnI和XbaI双酶切下300余bp片段

    图 2 rAAV-Kringle5在血管内皮细胞有较高表达（IF×100）

    2.2视网膜神经上皮细胞各组 实验组平均值A nm=0.323,阴性对照组平均值A nm =0.345,空白对照组平均值A nm=0.310。经过计算实验组和阴性对照组间及空白对照组比较t检验P >0.05；根据存活率=实验组光密度值/空白对照组光密度值, 抑制率=1-存活率，计算由腺伴随病毒载体介导的Kringle5基因对视网膜神经细胞实验组、阴性对照组和空白对照组的抑制率大致为5.6%。血管内皮细胞各组：实验组平均值A nm=0.2286，阴性对照组平均值A nm =0.4016 空白对照组平均值A nm=0.430。实验组和对照组比较t检验P <0.01；阴性对照组和空白对照组比较t检验P >0.05，计算血管内皮细胞实验组存活率=53%，阴性对照组存活率=0.4061/0.430=94.4%。抑制率=1-存活率; 实验组血管内皮细胞抑制率=47%；阴性对照组及空白对照组血管内皮细胞抑制率约5.6%（表1）。

    3讨论

    pSECTAG-kringle5载体由人民医院眼科中心实验室构建，我们根据载体的信号肽序列设计引物，在引物中引入KpnI和XbaI 酶切位点，将 Kringle5基因及γ信号肽基因亚克隆至质粒pSNAV形成pSNAV-Kringle5经过测序证实了引入片段及读码正确性。将构建好的pSNAV- Kringle5质粒进行腺伴随病毒包装rAAV-Kringle5形成病毒颗粒，包装滴度为2.5×1015v.g/L，检测滴度和纯度均达到我们试验要求。将含有目的基因带GFP标记腺伴随病毒按MOI=50感染血管内皮细胞。根据在荧光显微镜下观察细胞，发现目的基因在血管内皮细胞有较高表达[9]。在实验中Kringle5基因表达产物作用血管内皮细胞48h，光学显微镜下观察发现血管内皮细胞稀疏，生长缓慢说明其对血管内皮细胞在增殖和移行方面都有抑制作用同Ji等[10]报道；对照组及空白对照组细胞生长较快，密度较高。观察Kringle5基因表达产物对视网膜神经细胞影响实验组，阴性对照组，空白组细胞密度没有变化。根据MTT法计算在神经细胞实验组、空白对照组、阴性对照组间比较t检验P >0.05,说明几组之间差异没有显著性。说明表达产物对视网膜神经细胞没有影响，这一结果和我们光镜下观察相一致。上述各组视网膜神经上皮细胞抑制率为5.6%，出现这一结果可能由于实验中细胞计数，视网膜神经细胞对培养液要求较高等多种因素所致。根据MTT法计算血管内皮细胞实验组、空白对照组、阴性对照组间比较t检验，血管内皮细胞实验组和对照组差及与空白对照组比较也有显著性（P <0.01），说明表达产物对血管内皮细胞有抑制作用，根据MTT法计算表达产物对血管内皮细胞抑制率为47%；我们在细胞水平检测由腺伴随病毒介导Kringle5基因对血管内皮细胞和视网膜神经细胞的作用，其对血管内皮细胞有抑制作用而对视网膜细胞的生长没有影响。在基因治疗视网膜新生血管中，它不会影响视网膜生长和发育[11]。

    【参考文献】

    1 Cao YH. Kringle 5 of Plasminogen is a Novel Inhibitor of Endothelial Cell Growth. J Biol Chem ,1997;272:22924-22928

    2 Murata M, Nakagawa M,Takahashi S. Inhibitory effects of plasiminogen fragment on experimentally induced neovascularization of rat corneas. Graefes Arch Cin Exp Ophthalmol ,1997;235:584-586

    3 Drilxler TA , Rinkes IH,Ritchie ED. angiostatin inhibits pathological but not physiological retinal angiogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2001;42:3325-3330

    4 Meneses PI, Hajjar KA, Berns KI. Recombinant angiostatin prevents retinal neovascularization in a murine proliferative retinopathy model. Gene ther ,2001;8:646-648

    5 Cao Y, Ji RW kringle domains of human angionstatin characterization of the anti-poliferative activity on the endothelial cells. J Boil Chem ,1996;271:29461-29467

    6吴小兵,董小岩,一种快速简便的重组AAV病毒的纯化方法.科学通报,2000;45:2071-2075

    7奥斯伯.精编分子克隆生物实验指南.北京:科学出版社,1998:46-93

    8司徒镇强,吴军正.细胞培养.第1版.西安:世界图书出版公司,1996:181-187

    9 Zhao HS, Wang Y. Construction of relombinant adenoviral vector carrying the LEDGFp52 gene by homologous recombination in bacteria and its expression in vitro. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) ,2006;6(5):979-983

    10 Ji WR, Barrientos LG. selective inhibition by kringle5 of human plasminogen on endothelial cell Migration, an important process in angiogenesis. Biochem Bophys Res Commun,1998,247:414-419

    11卢春光,胡丹,惠延年.腺病毒介导的脑源性神经营养因子基因在培养的雪旺细胞中的表达.国际眼科杂志,2006;6(2):361-364

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