3讨论

    脂褐素又有“老年性色素”和“消耗性色素”之称。RPE细胞每天吞噬POS末端不断脱落的膜盘，其残留物积聚形成脂褐素，进而影响细胞的组织结构和生理功能的改变，促使细胞衰老乃至死亡。光感受器外节富含长链多不饱和脂肪酸，易受氧化损伤。在视网膜缺血缺氧、光照损伤等病理情况下，可以造成视网膜光感受器外节的损伤，大量膜盘脱落[9,10]。从而使RPE吞噬负担加重，大量形成脂褐素，则可能会造成RPE过度损伤及诱导细胞凋亡。以往文献报道，RPE中的脂褐素，很大一部分来源于氧化损伤的POS[11]。钙离子是细胞内各种生理活动重要的第二信使，也是细胞损伤重要的介导因素。正常静息状态下细胞内外Ca2+ 存在着约104倍左右的浓度差，细胞内Ca2+约为10-7~10-8 mol/L，而细胞外Ca2+ 浓度高达10-3~10-4 mol/L。维持胞内钙离子低浓度稳态对于保持细胞的正常功能具有很重要的作用。细胞内游离Ca2+ 浓度的升高，可以活化许多酶，耗竭ATP，产生自由基导致细胞许多成分的破坏，诱发细胞凋亡[12]。因而游离Ca2+ 平衡稳态的破坏与细胞损伤及衰老密切相关。在RPE吞噬POS形成脂褐素衰老过程中，钙离子是否担当了一定的角色？

    Fluo-3/AM荧光探针是新一代的长波钙离子荧光探针，敏感度及特异性高，用其负载胞内钙离子可以高效检测细胞内Ca2+ 的变化[13]。本实验采用激光扫描共聚焦显微镜测量Fluo-3/AM负载的钙离子荧光值，为胞内Ca2+ 荧光强度总和，代表细胞内总的Ca2+ 浓度。结果表明，培养人的RPE细胞和牛POS共培养后胞内Ca2+ 荧光强度显著增强，表示在此过程中胞内Ca2+ 浓度显著增高，其来源主要为胞外Ca2+ 的大量内流。本实验结果显示，培养人RPE细胞和牛POS共培养，脂褐素浓度随培养天数而增加，而胞内钙离子浓度的变化与脂褐素的变化并不呈平行关系。在共培养初期 (0.5d)，胞内钙离子荧光值显著升高，达到高峰777.3±63.89U (P <0.01)，因而我们推测在共培养产生脂褐素早期，RPE细胞接触识别并吞噬POS脱落膜盘阶段，钙离子内流可能起到了信号介导作用；而后随着培养天数的延长，胞内钙离子荧光值有所下降，但在一定时期 (8d) 内仍维持在较高值334.1±30.6U，与对照组相比仍有统计学显著性差异 (P<0.01)。钙离子荧光值有所下降可能是由于细胞内自有的缓冲作用，但其仍维持在一定高度表示胞内钙离子在脂褐素的产生及蓄积过程中可能仍在发挥作用。

    MTT比色法分析结果表示，在RPE和POS共培养的1d，细胞相对增殖率达到84.4%，细胞活力显著增强，但是随着RPE与POS共培养的天数的增加，细胞增殖率又有所下降。国外文献报道，细胞内Ca2+ 浓度的升高可以促进细胞的增殖[3]。本研究中1d细胞增殖率的升高考虑与RPE细胞脂褐素形成过程中细胞内Ca2+ 浓度的升高有关，2～8d细胞增殖活力的下降考虑为胞内钙超载及大量脂褐素的积聚造成了细胞的损伤，活力下降，甚至发生凋亡。

    在培养人RPE细胞和牛POS共培养形成脂褐素过程中，钙离子大量内流，其变化可能在脂褐素产生及蓄积过程中起到重要的作用，并在一定程度上影响细胞的增殖活力。过度的钙离子内流可造成胞内钙超载，可能是脂褐素蓄积损伤细胞结构与功能的原因之一。阻止钙离子的过度内流，是否可以缓和脂褐素的生成及减少其对细胞的损伤，从而预防老年性黄斑变性等由于脂褐素过度沉积所引起的病变，尚需进一步探讨。

    【参考文献】

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