图2  粘附磁珠作用的RPE细胞（×400）。A：未加磁场；B：磁场作用10min；C：磁场作用30min；D：磁场作用2h

   2.2 RPE的ET-1的表达 牵拉10，30min；2h后，观察6，24，48h的细胞爬片免疫组化染色，在牵拉30min组和2h组，ET-1的表达逐渐加强，2h组除随时间表达增强外，RPE形态变长（图3，4）。免疫组化图片：磁场作用30min，F =25.181，P <0.01，培养24和48h与对照组有统计学显著性差异（P <0.05，0.01，图5）。原位杂交图片：磁场作用10，30min；2h，培养24h后，F =15.732，P < 0.01，30min和2h与对照组有统计学显著性差异（P < 0.01，图6）。

    2.3细胞调理液中ET-1的含量  经牵拉的细胞调理液，经放射免疫测定（表1）：磁场作用10min，F= 5.754，P < 0.05，培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异   （P <0.05，0.01）。磁场作用30min，F  =6.366，P <0.05，培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异（P < 0.05，0.01）。磁场作用2h，F =6.96，P <0.05，培养24h和48h与对照组有统计学显著性差异（P <0.01，0.05）。作用组之间的相同观察时间用配对t检验比较均无统计学显著性差异。

    3讨论

    孔源性视网膜脱离的发生是一个多方面影响因素所导致的结果，其中，玻璃体对视网膜的牵拉和视网膜下液的重力作用，均可造成视网膜神经上皮与RPE的分离，而这种拉力会造成RPE的变形和损伤，在这样的过程中，会对RPE内部造成怎样的影响，一直是悬而未解的问题。本实验模型所生成的力是通过一块永磁铁作用在包被于细胞表面上的金属磁珠而产生的。可以近似地模拟视网膜脱离发病前RPE细胞在眼内的受力情况。前期工作发现，在这种磁场条件下，对培养人视网膜色素上皮细胞的增生和移行造成影响，并对RPE细胞内钙离子造成改变[5,6]。

    ET-1是最早从脐静脉内皮细胞条件培养基中发现的一种分子量为2.5KD (M, 2500D) 的活性物质，是21个氨基酸残基多肽，有较强收缩血管作用。随后的研究发现，ET-1不仅仅是血管收缩剂，而且是一种多功能调节肽，具有广泛的生物学效应，具有介导炎症、刺激其它激素分泌、促有丝分裂、刺激细胞增殖、移行和粘附等多种功能，通过自分泌和旁分泌方式经受体发挥作用。ET-1是一种多项生物学活性的多肽，具有促进细胞有丝分裂，促增生作用[7]，并且，前期工作，在视网膜脱离病人的玻璃体液中检测出ET-1的含量[1]，在视网膜脱离病人的手术中取出的增生膜中，检测出ET-1的细胞表达[8]，并探讨了ET-1 与增生膜收缩的关系[9]。那么，在RPE细胞，视网膜脱离的关键环节－牵拉会对ET-1的表达与分泌有怎样的影响？

    丝裂素活化蛋白激酶（mitogen activated proteinkinase，MAPK）级联是细胞内重要的信号转导系统，参与细胞生长、发育、分化和凋亡等一系列生理病理过程。细胞受力可以通过MAPK级联反应途径，刺激转录ET-1 mRNA[7,10]。White等[11]发现在血管内皮，血流的剪切力可以通过MAPK途径促进ET-1的分泌，以调节血管的紧张度。Liang 等[12]在体外培养的心肌细胞机械牵拉，细胞变形受力后可以使MAPK途径激活和转录ET-1 mRNA。实验显示，在牵拉后的形态观察中，随着牵拉时间的延长，RPE从在培养状态中的密度，形态都发生了改变。牵拉10，30min；2h后，观察培养6，24，48h的细胞爬片免疫组化和原位杂交染色，在牵拉30min组和2h组，ET-1的表达逐渐加强。，磁场作用10，30min；2h，培养24h后，ET-1mRNA的表达逐渐加强。图像分析显示，呈强度依赖性。经牵拉的细胞调理液，经放射免疫测定，磁场作用10，30min；2h，培养24和48h均与对照组有统计学显著性差异。作用组之间的相同观察时间用配对t检验比较均无统计学显著性差异。实验结果表明，RPE细胞受到牵拉后，RPE从形态和信号转道等多方面发生改变，因此，牵拉是视网膜脱离发生的原因之一，也是RPE细胞发生改变的一个因素。其中，受到牵拉后，表达ET-1增强，说明RPE细胞牵拉损伤后可能对ET-1的表达有一定的影响，因此，在RRD，牵拉可能是刺激视网膜表达和分泌ET-1的一个因素。

    【参考文献】

    1王建洲,惠延年,王丽丽,朱赛林,朱忠桥,马吉献,林国成.内皮素-1在裂孔性视网膜脱离玻璃体液中的含量测定.眼科研究,2003;21(2):116-117

    2 Narayan S, Prasanna G, Krishnamoorthy RR, Zhang X, Yorio T. Endothelin-1 Synthesis and Secretion in Human Retinal Pigment Epithelial Cells (ARPE-19): Differential Regulation by Cholinergics and TNF-alpha. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003;44(11):4885-4894

    3 Udono T, Takahashi K, Nakayama M, Yoshinoya A, Totsune K, Murakami O, Durlu YK,Tamai M, Shibahara S.. Induction of adrenomedullin by hypoxia in cultured retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2001;42 (5):1080-1086

    4王雨生,严密.可见光对原代培养人视网膜色素上皮细胞的光化学损伤.中华眼底病杂志,1996;12(3):174-176

    5侯旭,惠延年,韩泉洪,张晓光,王建洲,郭长梅.机械牵拉对培养人视网膜色素上皮细胞内钙离子的影响.国际眼科杂志,2005;5(1):50-54

    6侯旭,惠延年,韩泉洪,张晓光,王建洲,郭长梅,王海燕.机械牵拉对培养人视网膜色素上皮细胞增生和移行的影响.眼科新进展,2005;25(3):3205-3208

    7 Prasanna G, Narayan S, Krishnamoorthy RR, Yorio T. Eyeing endothelins: a cellular perspective. Mol Cell Biochem, 2003;253(1-2):71-88

    8王建洲,惠延年,马吉献.增生性玻璃体视网膜病变增生膜中内皮素的表达.第四军医大学学报,2003;24(10):921-922

    9王建洲,惠延年,马吉献,苏静波.内皮素与平滑肌激动蛋白在视网膜增生膜中的表达.第四军医大学学报,2002;23(7):623-625

    10 Angel P, Karin M. The role of Jun,Fos and the AP-1 complex in cell proliferation and transformation.Biochim Biophys Acta,1991;1072:129-157

    11 White CR, Haidekker MA, Stevens HY, Frangos JA. Extracellular signal-regulated kinase activation and endothelin-1 production in human endothelial cells exposed to vibration. J Physiol ,2004;555(Pt 2):565-572

    12 Liang F, Lu S, Gardner DG. Endothelin-dependent and -independent com- ponents of strain-activated brain natriuretic peptide gene transcription require extracellular signal regulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase. Hypertension,2000;35(1 Pt 2):188-192

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