2.5   共聚焦显微镜观察细胞形态变化

    对照组细胞Hoechst 33342染色见细胞核蓝色，规则圆形，大小均一(图3A)。冻融处理的细胞，镜下可见凋亡细胞的细胞核固缩而被Hoechst 33342染成亮蓝白色。不同冻融次数出现的凋亡细胞比率差异明显（表1）。0.5 ± 3组出现凋亡细胞为最多（图3B）。坏死的细胞，细胞膜消失，细胞内容物逸出，核内容物脱出呈带尾的丝状或礼花状（图3C）。凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多，达到一定程度后随着坏死细胞的增加反而减少。

    2.6   流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的改变

    冻融作用后,OCM-1细胞线粒体的膜电位下降,增加冻融次数,下降程度更加明显(表1)。

    2.7   流式细胞仪测定细胞CD40的阳性比率

    对照组的OCM-1细胞也有2.6% ± 0.3%的细胞表达CD40,随冻融次数增加，CD40表达率上升(表1)。

    3   讨   论

    3.1   冷冻治疗后，细胞内冰晶形成杀伤肿瘤

    Gage等[9]认为细胞内冰晶形成和冰晶的机械损伤是最重要的机制:细胞外液凝固结晶使细胞处于相对的高渗状态，致使细胞脱水和皱缩，而细胞外间隙形成的高渗状态使得冰晶容易通过细胞膜的微孔进入细胞，促使细胞内冰晶的形成，细胞膜的完整性被破坏。最后细胞内高度浓缩的电解质破坏细胞使之坏死、溶解。但是，此前的研究并没有发现冰晶的超微结构特征。本研究在电镜下发现早期冰晶形成的结构特征,直接证明了冻融通过形成细胞内冰晶杀伤肿瘤细胞，细胞外冰晶形成可以使细胞脱水、皱缩；而细胞内冰晶的形成则使细胞坏死、死亡。

    3.2   反复冻融诱发OCM-1细胞发生凋亡及其机制

    我们在临床上通过对视网膜母细胞瘤的冷冻治疗，发现冷冻灶没有明显的炎症反应，但是肿瘤最后呈退变型疤痕愈合。这说明冰晶损伤只是早期急性杀伤反应，冷冻应该还通过其他更加重要的机理杀伤肿瘤。Baust等[8]提出诱导大量肿瘤细胞的凋亡是冷冻杀伤肿瘤的另一个重要机制，可能与细胞膜磷脂外翻，激活半胱天冬酶，DNA非随机性断裂等作用有关。Jennica 等[10]认为P16是细胞周期调节蛋白之一，其作用是与细胞周期素D竞争性结合CDK4/6,阻止细胞从G1期至S期的进程，从而对有丝分裂进行负反馈调节。在肿瘤细胞中由于基因的突变或缺失，往往导致P16表达的增加。在研究细胞凋亡机制的实验中发现，线粒体膜电位下降,可使细胞的通透性增加，释放细胞色素C,前体半胱天冬酶分裂，引起细胞骨架蛋白降解、核膜破裂、DNA降解等一系列损伤改变[11、17]。当这种损伤改变超过细胞自身的修复能力时,细胞将死亡(凋亡及坏死)。本实验发现，冻融后在共聚焦显微镜下能见到核固缩而被Hoechst 33342染成典型呈亮蓝白色的凋亡细胞，电镜下也可见到较多的凋亡细胞；凋亡细胞的比率随着冻次数的增加而增高，证实了反复冻融可以诱发大量的肿瘤细胞凋亡，我们认为多次冻融诱导肿瘤细胞发生凋亡，为杀伤肿瘤及诱导肿瘤退变更为重要的机理。对照组的细胞P16免疫组织化学染色呈阳性,冻融后的细胞则呈阴性反应；流式细胞仪检测发现瘤细胞线粒体膜电位下降,且变化的幅度与凋亡细胞比率的变化幅度相符，这些均提示冻融对肿瘤细胞的杀伤还存在着后续作用,细胞的增值能力被明显抑制，无限恶性增殖的趋势暂时停滞，为抑制残存细胞的增殖生长的机制之一。而线粒体膜电位的下降，P16表达的下调是冻融诱发细胞凋亡的关键环节。

    3.3   冷冻治疗可能能够活化CD40配体，介导机体免疫杀伤

    有研究[12]发现冻融后可激发机体的细胞免疫应答对肿瘤细胞产生杀伤作用。也有文献报道冻融后肿瘤细胞可以释放抗原从而致敏树突细胞（dendritic cell ,DC)激活免疫应答[13]。但是，冻融通过何种机制激发机体免疫应答还不确切。为了进一步研究冷冻治疗后增强免疫应答的机制，我们作了细胞CD40表达的流式细胞仪检测。CD40分子是肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的成员之一，可以表达于不同分化阶段的B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等细胞上，它通过与活化T细胞上CD40配体相互作用，不仅可以作用于B细胞和调节机体体液免疫应答，而且可以增加T细胞、树突状细胞、巨噬细胞等细胞的免疫功能，诱导细胞因子的产生，从而影响机体细胞免疫反应[14]。CD40分子激发后的树突状细胞可以不需CD4+ 细胞的辅助，直接活化CD8+细胞毒性T细胞（CTL）[15，16]。实验中发现随着冻融次数的增加，瘤细胞CD40的表达增强，并呈一定的量效关系，提示冻融通过上调细胞CD40的表达，活化CD40配体，可能是增强机体的免疫应答，介导机体免疫杀伤瘤细胞的机理。

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