IL-1β对人视网膜色素上皮细胞胶原合成的作用

　　第四军医大学学报1999年第20卷第8期

　　冯学峰　惠延年　王雨生

　　摘　要　目的: 观察白介素-1β (IL-1β)对培养的人视网膜色素上皮细胞(RPEC)胶原合成的作用.方法： 用3H-脯氨酸参入和免疫细胞化学方法观察IL-1β对培养的人RPEC胶原合成活性的影响.结果： IL-1β能增强RPEC合成胶原的活性，在10 μg/L浓度使RPEC对3H-脯氨酸的摄取增加145% （P＜0.05），并增强Ⅳ,Ⅰ和Ⅲ型胶原荧光染色.结论： IL-1β能刺激RPEC合成胶原，可能在增殖性玻璃体视网膜病变的胶原沉积中起作用.

　　关键词：白介素-1β　视网膜色素上皮细胞　胶原合成　细胞培养

　　0　引言

　　增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)的发病机制仍未完全了解. 过去的研究集中在细胞增生过程中，而细胞外基质的合成沉积也是一个重要的病理过程，文献中对此少见报告［1］. 细胞因子可能在其中起重要作用. 我们观察了IL-1β对PVR中主要细胞成分视网膜色素上皮细胞(RPEC)胶原合成的作用，报告如下.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　人重组IL-1β为军事医学科学院产品，由第四军医大学金伯泉教授惠赠. 3H-脯氨酸为中国原子能研究所产品. 鼠抗人Ⅳ型胶原单克隆抗体为美国Sigma产品，兔抗人Ⅲ型和Ⅰ型胶原多克隆抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品.

　　1.2　方法

　　1.2.1　RPEC培养与鉴定　从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球，于死亡后12 h内进行分离、培养RPEC［2］. 用鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体进行细胞鉴定. 选3代～6代细胞用于实验.

　　1.2.2　3H-脯氨酸参入实验　将已铺满的RPEC (96孔板), 每孔分别加入200 μL， 50 mL/L小牛血清DMEM液，内含维生素C 100 mg/L及不同浓度的IL-1β (0, 0.01, 0.1, 1和10 μg/L). 培养24 h后，同上换液，每孔加入74 kBq 3H-脯氨酸，继续培养24 h. 收集细胞于F4玻璃纤维滤纸. 自动液闪计数仪测定样品的放射性cpm值. 每个浓度设4个复孔. 实验重复3次.

　　1.2.3　Ⅰ，Ⅲ和Ⅳ型胶原免疫细胞化学染色　培养RPEC于盖玻片至细胞铺满. 然后换成100 mL/L小牛血清DMEM培养液，内含维生素C 100 mg/L及 IL-1β (10 μg/L)，并设空白对照. 48 h后捞出盖玻片, PBS漂洗，自然干燥. 作常规间接免疫荧光染色. 设立阳性对照组(正常人皮肤成纤维细胞)和阴性对照组(以PBS替代一抗), 荧光显微镜观察并照相.

　　统计学处理: 结果以均数±标准差(X±s)表示, 做t检验.

　　2　结果

　　2.1　培养的人RPEC的生长及鉴定　在倒置相差显微镜下，原代培养人RPEC呈六边形和多边形，胞质内充满黑色素粒，传3代黑色素粒基本消失. 免疫细胞化学染色显示细胞质内呈特异性抗角蛋白棕褐色网状染色.

　　2.2　3H-脯氨酸参入实验　随IL-1β浓度增加，RPEC的3H-脯氨酸参入cpm值逐渐增加(Fig 1). 1 μg/L 和10 μg/L时，分别为对照的126%和145% (P＜0.05).

　　图1　对照组RPEC细胞Ⅰ型胶原免疫荧光染色

　　2.3　Ⅰ,Ⅲ和Ⅳ型胶原免疫细胞化学染色　空白对照组, I和Ⅲ型胶原阳性反应类似，均呈黄绿色、细颗粒状，位于胞浆核周，细胞之间的染色强度不一致(Fig 2). Ⅳ型胶原胞质内呈弱荧光，细胞外呈稀疏细网状分布(Fig 3). 在IL-1β作用组，I和Ⅲ型胶原着色强度及范围增加(Fig 4)；Ⅳ型胶原在细胞外呈浓密的网状结构(Fig 5). 阳性对照片细胞外可见Ⅰ, Ⅲ型胶原呈网状及致密团块状，阴性对照片未见荧光染色.

　　图2　对照组RPEC细胞Ⅳ型胶原免疫荧光染色

　　图3　IL-1β处理组RPEC细胞Ⅰ型胶原免疫荧光染色

　　图4　IL-1β处理组RPEC细胞Ⅳ型胶原免疫荧光染色

　　图5　IL-1β对RPEC细胞3H-脯氨酸参入cpm值的影响

　　3　讨论

　　rPEC是PVR的主要细胞成分. 在PVR起动因素的作用下，RPEC等细胞移行至玻璃体内，粘附在视网膜表面，增生并产生细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，在玻璃体内及视网膜表面形成有收缩能力的膜, 膜收缩造成牵拉性视网膜脱离. ECM对RPEC和胶质细胞有趋化和增生调控作用，并参于膜收缩［1］. 因此，ECM的合成和沉积是PVR的重要病理过程. 但RPEC合成分泌细胞外基质的具体调控因素和作用机制还未完全明了.

　　我们选择了IL-1β，观察它对培养的人RPEC胶原(细胞外基质的主要成分)合成的作用. 结果显示IL-1β能刺激RPEC合成胶原蛋白，在浓度为10 μg/L时，RPEC的胶原合成增加约145%. IL-1被认为是细胞间信号传递的最基本的介质，具有广谱的多功能活性［3］. 它不仅是炎前因子，对不同来源的细胞有刺激及抑制增殖作用，而且对不同来源的细胞有刺激及抑制胶原合成的作用. 在PVR中，玻璃体及视网膜下液有较高水平的IL-1β表达［4］，它主要来源于巨噬细胞及RPEC细胞，因此它可能以自分泌和旁分泌的方式来调控RPEC在生理及病理状况下的胶原合成.

　　Ⅰ型和Ⅲ型胶原是PVR增生膜的重要基质成分［1］. 本实验结果显示，IL-1β虽然可以刺激RPEC合成Ⅰ， Ⅲ型胶原，但无细胞外分泌，而Ⅳ型胶原有大量的细胞外分泌. 对此可能的解释是，培养的RPEC合成Ⅳ型胶原的反应性增强. 本实验条件下，RPEC表型无改变. 文献［5］报告，RPEC在表型改变后，合成和分泌胶原增加. 在PVR形成过程中，影响和调节RPEC胶原合成的因素可能很多，作用机制尚待研究. 但本实验显示，IL-1β可以促进RPEC合成胶原，提示它在PVR病程胶原沉积环节中起作用.

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目　No. 39470742

　　作者简介：冯学峰，女，1965-02-06生，陕西米脂人，汉族. 1986年西安医科大学医疗系本科毕业，1989年获西安医科大学眼科学硕士，1998年获第四军医大学西京医院眼科博士，发表论文10篇. 现在西安医科大学第一临床医学院眼科. 电话：(029)5252981-2412（办）

　　作者单位：第四军医大学西京医院眼科，陕西 西安 710033

　　参考文献

　　1 冯学峰，惠延年. 细胞外基质在增殖性玻璃体视网膜病变中的作用(综述). 国外医学眼科学分册， 1997；21(6)：348-353

　　2 王雨生，严　密. 可见光对原代培养人视网膜色素上皮细胞的光化学损伤. 中华眼底病杂志， 1996；12(3)：174-176

　　3 Di Giovine FC, Duff GW. Interleukin 1: the first interleukin. Immunol Today，1990；11(1):13-20

　　4 Limb GA, Little BC, Meager A et al. Cytokines in proliferative vitreoretinopathy. Eye, 1991；5(6):686-693

　　5 Martini B, Wang HM, Lee MB et al. Synthesis of extracellular matrix by macrophage-modulated retinal pigment epithelium. Arch Ophthalmol，1991；109(4):576-580