作者：郭梦翔， 朱晓波， 罗 燕， 高 艺， 唐仕波   

    作者单位：中山大学中山眼科中心∥眼科学国家重点实验室， 广东 广州

    【摘要】  【目的】 探讨银杏内酯Ｂ拮抗谷氨酸诱导的体外培养新生大鼠视网膜神经细胞凋亡作用及其可能的机制。 【方法】 ＭＴＴ法检测不同浓度谷氨酸对原代培养ＳＤ大鼠视网膜神经细胞的兴奋性毒性作用。细胞分为正常组、谷氨酸组和不同浓度（１０、５０、１００ μｍｏｌ／Ｌ）银杏内酯Ｂ治疗组（ｎ ＝ ６）。ＭＴＴ法检测不同浓度的银杏内酯Ｂ对谷氨酸诱导凋亡的视网膜神经细胞存活率的影响。流式细胞仪结合Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ ＰＩ检测细胞凋亡率，ＪＣ-１染色检测线粒体膜电位。【结果】 １００ μｍｏｌ／Ｌ谷氨酸作用下，视网膜神经细胞的吸光度值降低至０．５０ ± ０．０７，凋亡率为５２．４％，ＪＣ-１的红／绿比值为１．７７。１０ ～ １００ μｍｏｌ／Ｌ银杏内酯Ｂ作用下神经细胞的吸光度值分别为０．５２ ± ０．０９、０．６４ ± ０．１５和０．７４ ± ０．１１，细胞的凋亡率分别下降至３６．７％，１２．４％和２．１％，ＪＣ-１的红／绿比值则分别上升为１．８９８、２．０８９、２．２７６（Ｐ ＜ ０．０５）。 【结论】 银杏内酯Ｂ可以拮抗谷氨酸诱导的视网膜神经细胞凋亡，其作用机制可能与提高线粒体膜机能有关。

    【关键词】  视网膜神经细胞培养； 谷氨酸； 银杏内酯Ｂ； 凋亡

    Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｅ Ｂ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｌｕｔａｍａｔｅ-ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｎ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ

    ＧＵＯ Ｍｅｎｇ-ｘｉａｎｇ， ＺＨＵ Ｘｉａｏ-ｂｏ， ＬＵＯ Ｙａｎ， ＧＡＯ Ｙｉ， ＴＡＮＧ Ｓｈｉ-ｂｏ

    （ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ∥Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ， ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

    Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００６０， Ｃｈｉｎａ ）

    Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｅ Ｂ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｕｔａｍａｔｅ-ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ． 【Ｍｅｔｈｏｄ】 Ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗａｓ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＭＴＴ． Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ６ ｇｒｏｕｐｓ： Ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ， Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｇｒｏｕｐ， １０ μｍｏｌ／Ｌ ＧＢ-ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ， ５０ μｍｏｌ／Ｌ ＧＢ-ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ， ａｎｄ １００ μｍｏｌ／Ｌ ＧＢ-ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ （ｎ ＝ ６）． Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗａｓ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＭＴＴ， ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ ＰＩ ａｎｄ ＪＣ-１ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． 【Ｒｅｓｕｌｔ】 Ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ １００ μｍｏｌ／Ｌ ｇｌｕｔａｍａｔｅ， ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗｅｒｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｏ ０．５０ ± ０．０７， ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｅ ｗａｓ ５２．４％ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｄ／ｇｒｅｅｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＪＣ-１ ｗａｓ １．７７． Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｅ Ｂ ｉｎ １０ μｍｏｌ／Ｌ ～ １００ μｍｏｌ／Ｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｒａｔｅ ｔｏ ０．５２ ± ０．０９， ０．６４ ± ０．１５， ａｎｄ ０．７４ ± ０．１１， ｗｈｉｌｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｅ ｔｏ ３６．７％，１２．４％， ａｎｄ ２．１％ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｒｅｄ／ｇｒｅｅｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＪＣ-１ ａｓｓａｙ ｔｏ １．８９８， ２．０８９， ａｎｄ ２．２７６ （Ｐ ＜ ０．０５）． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｅ Ｂ． Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ．

    Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｇｌｕｔａｍａｔｅ； ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｅ Ｂ； ａｐｏｐｔｏｓｉｓ

    ［Ｊ ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ Ｓｃｉ），２００８，２９（６）：６９０－６９４］

    视网膜神经细胞，特别是光感受器细胞凋亡是视网膜变性性疾病的共同病理通路［１－２］。Ｃｌａｒｋｅ等认为在视网膜变性疾病中感光细胞变性可能与谷氨酸等兴奋性氨基酸在局部积聚有关［３］。银杏内酯Ｂ（ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｅ Ｂ， ＧＢ）是银杏叶提取物中的主要药效成分，是目前已知最强的天然特异性血小板活化因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ-ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＰＡＦ）拮抗剂，体外实验证实，银杏内酯Ｂ可以拮抗谷氨酸诱导的培养脑皮质神经细胞凋亡［４－５］。在本研究中，我们建立谷氨酸诱导的原代培养的大鼠视网膜神经细胞凋亡模型，观察银杏内酯Ｂ对视网膜神经细胞的保护作用，并进一步探讨可能的作用机制，以期为视网膜变性疾病的治疗提供新的途径。

    １ 材料与方法

    １．１ 实验动物

    出生后７ ～ ８ ｄ的ＳＤ乳鼠，雌雄不拘，由中山大学实验动物中心提供，粤监证字２００６Ａ０６４。

    １．２ 主要试剂和仪器

    兔抗神经原特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）多克隆抗体、兔抗胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）多克隆抗体、ＳＡＢＣ-ＦＩＴＣ和ＳＡＢＣ-ＣＹ３免疫组织化学试剂盒均购自武汉博士德公司；小鼠抗视紫红质单克隆抗体（Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ，美国ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）； ＡｎｎｅｘｉｎⅤ／ＰＩ检测试剂盒（深圳晶美），ＪＣ-１荧光探针（美国 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ），银杏内酯Ｂ（含量≥９８％）（南京海陵中药制品公司）。流式细胞仪（美国Ｂｅｃｋｍａｎ-Ｃｏｕｌｔｅｒ），酶标仪（美国ｓｉｇｍａ）。

    １．３ 方 法

    １．３．１ 视网膜神经细胞的培养和鉴定 按文献［６］报道方法培养新生ＳＤ大鼠视网膜神经细胞。细胞培养７ ｄ后，以ＮＳＥ、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ 和ＧＦＡＰ为一抗，相应的荧光抗体为二抗，免疫荧光双染对培养细胞进行鉴定。阴性对照采用ＰＢＳ代替一抗。

    １．３．２ 噻甲唑兰（ＭＴＴ）法检测不同浓度谷氨酸对视网膜神经细胞存活率的影响 调整视网膜神经细胞的浓度为１×１０５／ｍＬ，每孔２００ μＬ接种于多聚赖氨酸提前包被的９６孔板内，在３７℃、５％ＣＯ２的培养箱内培养，至第７天随机分为３大组：正常对照组、１００ μｍｏｌ／Ｌ谷氨酸组和１ ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酸组，其中后两组分别按照谷氨酸干预后３０ ｍｉｎ、１ ｈ、２ ｈ、８ ｈ和１２ ｈ分为５小组，每组设５个复孔，同时设定空白对照孔。在不同时间点终止干预，按ＭＴＴ法常规操作，测定并记录各孔在４９０ ｎｍ的吸光度值（Ａ）。细胞存活率（％） ＝ 各组测定的吸光度值／正常对照组吸光度值 × １００％。

    １．３．３ ＭＴＴ法测定ＧＢ对视网膜神经细胞存活率的影响 实验共分为５组。神经细胞接种后７ ｄ分组：Ａ组（正常对照组）及Ｂ组（谷氨酸模型组）分别给予正常培养液及１００ μｍｏｌ／Ｌ谷氨酸干预１２ ｈ，ＰＢＳ洗两次后换用新鲜培养液继续培养１２ ｈ；Ｃ ～ Ｅ组（ＧＢ治疗组）：培养第６天分别加入浓度为１０、５０和１００ μｍｏｌ／Ｌ的ＧＢ培养２４ ｈ，再加入１００ μｍｏｌ／Ｌ 谷氨酸干预１２ ｈ后终止干预，ＰＢＳ洗两次后换用新鲜培养液继续培养１２ ｈ。ＭＴＴ法测定各组吸光度值，计算细胞存活率。

    １．３．４ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ细胞凋亡检测 按方法１．３．３项下分组干预细胞，终止干预后，ＰＢＳ洗细胞两次，加入稀释的结合缓冲液２００ μＬ重悬细胞；加入３ μＬ  Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＦＩＴＣ混匀，室温避光１０ ｍｉｎ；继续加入２ μＬ ＰＩ，混匀，室温避光５ ｍｉｎ；补充结合缓冲液３００ μＬ混匀，流式细胞仪检测。

    １．３．５ 流式细胞仪检测线粒体膜电位变化 按方法１．３．３项下分组干预细胞，终止干预后，ＰＢＳ 洗细胞两次。以无酚红ＤＭＥＭ 培养液配置浓度为０．２ μＬ／ｍＬ 的ＪＣ-１ 染液，每管细胞沉淀加入５００ μＬ吹打混匀，３７ ℃ 避光孵育３０ ｍｉｎ。３００ × ｇ离心５ ｍｉｎ，弃上清，５００ μＬ ＰＢＳ 重悬细胞，流式细胞仪检测。

    １．３．６ 统计方法 采用ＳＰＳＳ１２．０软件包中的单因素方差分析法（ＡＮＯＶＡ）对数据进行分析，结果以平均数 ± 标准差（ｘ ± ｓ）表示。以Ｐ ＜ ０．０５表示差别具有显著性意义。

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