2  结果

　　2.1  裂隙灯显微镜观察结果

　　术后第1天，两组动物均有球结膜充血、前房闪辉。术后第4天，两组球结膜充血减轻，前房闪辉减少。术后第1周，球结膜充血和前房闪辉消失。术后第2周，植入膜片周边出现白色降解点状浸润(见图1、图2)，随观察时间延长，范围逐渐扩大并向植片中心进展(见图3、图4)。术后第8周，A组膜片中央出现降解浸润，皱褶屈曲不明显（见图5）；B组膜片全部浸润，其明显皱褶屈曲（见图6），在各观察时间点，A组降解浸润程度小于B组。术后第6周，两组各有1例角膜上皮缺损（见图7、图8）。术后8周内，A组未见角膜新生血管发生，B组有2例发生角膜新生血管，但范围未及角膜1/3，且未接近植片周围（见图8、图9）。

　　2.2  切片染色结果

　　术后第8周，A组膜片表层少量降解，降解物质与角膜基质融合，材料边界易辨认，膜片周围角膜基质少量炎性细胞浸润，角膜基质纤维排列有序(见图10、图11)；B组膜片表层降解程度大于A组，膜片结构疏松，膜片周围角膜基质有较多炎性细胞浸润，多为中性粒细胞，降解材料与角膜基质交织融合(见图12、图13)。

　　3  讨论

　　在组织工程支架材料方面，羊膜作为组织工程化角膜上皮细胞的载体， 已经应用于临床治疗眼表疾病并取得了一定的成效[3]。但羊膜有一定的局限性，如羊膜组织较薄，不是完整均匀的全透明组织，并且可能携带病原体[4]。因此，我们亟待寻找一种性能更优的替代物。

　　壳聚糖是一种新型的生物工程材料，生物学特性优良，具有较好的组织相容性和生物可降解性，无毒、无刺激、无抗原性，可促进生长因子的合成，可以作为生长因子释放的载体，具有抑制纤维细胞生长、促进上皮细胞分化的作用，已广泛应用于医学科学的各个领域[5]。

　　壳聚糖与胶原复合，由于壳聚糖带正电荷而胶原带负电荷，两者除了以氨基和羟基结合外，还以静电引力相结合，增加了其稳定性，弥补了壳聚糖强度不高的缺陷，增加了胶原的组织相容性[6]。Zhu等[7]研究了脂肪组织源性干细胞在壳聚糖胶原复合物支架上的增生情况，结果显示其黏附性、扩增性以及生物活性均较好，有望成为一种性能更加良好的角膜组织工程支架。

　　本实验将壳聚糖胶原复合膜和壳聚糖膜分别植入兔角膜基质层间，术后两组均有炎症反应发生，组织学切片显示，实验组炎症程度小于对照组，可见角膜对复合膜的适应性更加良好。角膜新生血管的发生会破坏角膜的免疫赦免状态，是导致角膜移植术后免疫排斥反应的高危因素[8]。角膜营养通路的切断、角膜缺氧、炎性细胞的浸润等均可导致新生血管的生长[9]。本研究中，实验组在术后8周内均未发现角膜新生血管，而对照组发生2例角膜新生血管，可见复合膜的组织相容性相对要优于壳聚糖膜，不易诱发新生血管。角膜上皮缺损多因角膜营养通路的部分阻断，导致上皮营养供给不足，同时上皮基底膜结构的破坏，引起层黏连蛋白减少，致上皮细胞疏松、无法附着而引起[10]。两组各出现1例角膜上皮点状缺损，但实验组的缺损程度轻于对照组，可见其对于角膜局部代谢的影响相对要小。膜片降解开始后的各时间点，复合膜降解程度小于壳聚糖膜，这在后期得到组织学检查的证实。总之，壳聚糖胶原复合膜比壳聚糖膜炎症反应轻，对角膜的局部影响小，不易诱发新生血管，呈现出较好的活体组织相容性。

　　有关壳聚糖膜方面，丁勇等[11]将大小5 mm×4 mm，厚度约0.5 mm 壳聚糖材料植入兔眼角膜囊袋内，术后第1周即有角膜新生血管，术后第4周新生血管长入植入的材料周围，术后第8周自然消退。本实验中，采用大小4 mm×4 mm，厚度约0.02 mm 壳聚糖膜，术后第6周始发生角膜新生血管，范围仅在角巩缘处周边且未接近植片周围，相比起丁勇的研究，新生血管生长时间延迟，范围较小。分析认为：采取相同材料、厚度不同的材料植入时，对角膜局部营养通路的影响作用受厚度的影响，厚度越大，对角膜局部环境影响越大，新生血管长入的危险性也随之增大。本实验中，壳聚糖膜组角膜新生血管尚未自然消退，推测可能与观察时间太短有关。

　　近年来，角膜修复的组织工程材料的另一个研究热点是用异种脱细胞角膜基质植入活体动物角膜，多在术后第2周左右有角膜新生血管长入，引起排斥反应，同时，异种角膜基质仍可能会引入抗原成分，导致严重的炎症反应[12]。本研究中采用壳聚糖胶原复合膜植入兔角膜基质，炎症反应轻微，在观察时间内无新生血管长入角膜，具有良好的组织相容性，而且获取途径相对简单，制备技术容易掌握，其应用前景更加广阔，但是植入后的长期组织相容性以及材料降解行为仍需进一步研究探索。

　　【参考文献】

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　　[6] 王迎军，赵晓飞，卢玲，等. 角膜组织工程支架壳聚糖-胶原复合膜的性能[J]. 华南理工大学学报(自然科学版)，2006，34(8)：2-5.

　　[7] Zhu Y， Liu T， Song K， et al. Collagen-chitosan polymer as a scaffold for the proliferation of human adipose tissue-derived stem cells[J]. J Mater Sci Mater Med，2009，20：799-808.

　　[8] M.Reza Dana and J. Wayne Streilein.Loss and restoration of immune privilege in eyes with corneal neovascularization[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science，1996，37(12)：2485-2494.

　　[9] 李凤鸣. 眼科全书(上册)[M]. 北京：人民卫生出版社，1996：311.

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　　[11] 丁勇，徐锦堂，吴春云，等. 壳聚糖植入兔角膜的生物学反应[J]. 暨南大学学报(医学版)，2003，24(4)：28-32.

　　[12] 张姝江，张美霞，杨志明. 两种生物衍生材料修复兔角膜浅层缺损的初步实验研究[J]. 中国修复重建外科杂志，2006，20(4)：463-466.

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