【摘要】 目的 评估血管内皮抑素对lewis肺癌的抗肿瘤作用。 方法 将lewis肺癌细胞系和荷lewis肺癌细胞的C57鼠分别进行不同剂量血管内皮抑素的药敏试验。 结果 血管内皮抑素可以诱导细胞凋亡，凋亡程度与内皮抑素剂量呈正相关。内皮抑素对鼠lewis肺癌有明显的抑瘤作用和抗肿瘤肺转移作用，也明显抑制血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)的表达，作用程度与内皮抑素剂量呈正相关。应用内皮抑素未观察到消化道反应等类似化疗的副作用，也未观察到其它严重不良反应。 结论 血管内皮抑素有抗肿瘤生长作用。
【关键词】 血管内皮抑素 lewis肺癌 凋亡 血管内皮生长因子(VEGF) 微血管密度(MVD)
1971年Follunan首次提出肿瘤依赖血管生成学说，肿瘤细胞通过血管获得生长所需营养，血管为肿瘤转移提供通道［1］。因此，抑制肿瘤新生血管形成，可抑制肿瘤生长和转移［2］。血管内皮抑素(Endostatin)是1997年哈佛大学的O 'Reilly等［3］发现的一种强有力的血管新生抑制因子。本实验通过对lewis肺癌细胞系及荷lewis肺癌细胞的C57鼠的药敏实验研究内皮抑素对lewis肺癌产生的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料 lewis肺癌细胞系(LLC) 购自上海中科院细胞库；C57小鼠购自北京维通利华公司。
1.2 实验药物 血管内皮抑素广东星湖科技公司惠赠；顺铂购自南京制药厂；注射用水购自天津药业集团。
1.3 试剂 DMEM培养基购自天津圣东科技发展公司; MTT购自天津圣东科技发展公司; 胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所; 二甲基亚砜购自天津市化学试剂一厂; 胰酶购自Sigm公司; 试剂盒Annexin V-FITC购自晶美生物工程有限公司; SP9003购自北京中山金桥生物技术有限公司；PV6002购自天津市灏洋生物制品科技有限公司；P170购自美国贝克曼库尔特公司；Anti VEGF(C-1) Antibody，PECAM-1购自天津市灏洋生物制品科技有限公司。
1.4 器材 流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；普通光学显微镜购自OLYMPUS公司；二氧化碳孵育箱购自香港力康发展有限公司；超级净化工作台购自造鑫企业有限公司；湘仪离心机TDSA—WS购自天象人生物工程有限责任公司；细胞培养板、培养瓶为美国进口；振荡器购自TECAN公司；普通冰箱购自西门子公司。
1.5 利用流式细胞技术检测细胞凋亡 取生长旺盛的lewis肺癌细胞7瓶，分别加入血管内皮抑素15、12、8μg、血管内皮抑素8μg+顺铂30μg、顺铂30μg、DMSO 100μl、培养基。加药24h后检测细胞凋亡,按照凋亡试剂盒说明书进行操作,重复3次。
1.6 60只C57小鼠随机分为6组，每组10只。将lewis肺癌细胞制成单细胞悬液注射于小鼠的左腋下，每只小鼠注射0.1ml。两周后为6组荷瘤鼠分别皮下注射血管内皮抑素400μg/d/只、300μg/d/只、200μg/d/只和血管内皮抑素200μg+顺铂40μg/d/只及第五组顺铂40μg/d/只，第六组为注射用水0.1ml/d/只。6组的给药时间均为10d。
1.7 肿瘤生长曲线的绘制 于加药后每周用游标卡尺测肿瘤长径1次，共计3次。每组取平均值绘制肿瘤生长曲线。
1.8 免疫组织化学染色(VEGF和MVD) 将肿瘤和肺的标本用10%甲醛固定24h取材，常规脱水后石蜡包埋。所有蜡块连续切片4张，1张作HE染色，另两张作免疫组化，余备用。按免疫组化试剂盒说明书进行操作，分别做VEGF和MVD染色。
1.9 结果判定
1.9.1 VEGF的检侧 VEGF为细胞浆着色，清晰棕黄色为阳性判断标准。首先在低倍视野下(100倍)扫视整张石蜡切片，每张切片找出5个微血管密集区，然后在高倍视野下(400倍)记数。每张切片共计数5个视野。 判定标准：(-):无阳性染色细胞，(+):阳性细胞数<25%，(++):阳性细胞数26%～50%,(+++):阳性细胞数>50%。
1.9.2 MVD计数方法 首先在低倍视野下(100倍)扫视整张石蜡切片，每张切片找出3个微血管密集区，然后在高倍视野下(400倍)记数。每张切片共计数3个视野,每组计数3张切片。 微血管的判断标准：(1)与邻近的微血管、肿瘤细胞及其它结缔组织成份不相连的、标记清晰的内皮细胞及内皮细胞簇均可做为一个可计数的微血管。(2)可能源于同一微血管的内皮细胞，如染色清晰且相互分离，也可做为单独的微血管计数。(3)血管腔及腔内红细胞的存在不是确认微血管的必备条件。(4)对肿瘤区内的硬化区、肿瘤细胞稀疏区及邻近良性组织区域内的血管不进行计数。(5)对管腔直径大于8个红细胞或管壁有平滑肌存在的血管不进行计数。
1.10 统计学处理 统计学处理采用SPSS11.5统计软件。
2 结果
2.1 利用流式细胞技术检测细胞凋亡，重复3次。15μg血管内皮抑素组与12μg血管内皮抑素组凋亡率高于其它各组，差异有统计学意义（P<0.05）。血管内皮抑素可以诱导细胞凋亡，凋亡程度与内皮抑素剂量呈正相关。
图1 15μg内皮抑素组凋亡图（略）
2.2 肿瘤生长曲线 不同浓度的血管内皮抑素和顺铂联合血管内皮抑素作用于荷瘤C57鼠产生的影响呈现出如图的趋势。各浓度组均呈现明显的时间—效应关系。对照组肿瘤平均直径明显大于各实验组且生长速度快。
2.3 抑瘤率 结果为抑瘤率DDP组为最高，与其它各组有差异P<0.05；400μg组和300μg组次之；200μg+DDP组再次；200μg组抑瘤作用最弱。
2.4 肿瘤组织VEGF 统计学分析显示对照组与其余各组之间均存在显著差异(P<0.01)。400μg组与顺铂组之间存在统计学差异(P<0.05)。400μg组与合用组之间存在统计学差异(P<0.05)。400μg组与200μg组之间存在统计学差异(P<0.05)。300μg组与200组之间存在统计学差异(P<0.05)。结果显示400μg与300μg组肿瘤组织VEGF量最少，这两组之间不存在差异。200μg+DDP组、200μg组和DDP组VEGF量次之，它们之间不存在差异。对照组肿瘤组织中VEGF量最多与其余各组均有统计学差异。
图2 血管内皮抑素对肿瘤生长曲线图（略）
图3 血管内皮抑素Lewis细胞VeGF的影响（略）
2.5 肿瘤组织微血管密度 结果表明400μg和300μg组肿瘤微血管密度最小，这两组彼此无差异(P>0.05)。200μg加DDP组肿瘤微血管密度次之。200μg组肿瘤微血管密度再次。DDP组肿瘤微血管密度在各实验组中最多。对照组肿瘤微血管密度最大与其它各组均有差异(P<0.05)。
图4 血管内皮抑素对组织血管密度的影响（略）
3 讨论
恶性肿瘤具有无限制浸润性生长和远处转移两大特征，而血管生成是肿瘤浸润生长与转移的一个重要前提。因此，抑制血管的生成对肿瘤的治疗有深远的意义和广阔的前景。传统的抗肿瘤药物由于靶向性差，较易产生毒副作用，而血管抑制疗法为目前的肿瘤治疗提供了一个新途径。随着科学工作者三十余年的不懈努力，目前已发现了多种血管生长抑制因子［1～3］，其中内皮抑素抑制血管新生和抗肿瘤作用最为明显［4］。
内皮抑素是O'Reilly等从鼠内皮细胞瘤(EOMA)培养液中首次分离出内源性的血管生成抑制剂，经研究发现与血管抑制素(Angiostatin)不同，经克隆鼠内皮抑素基因重组的内皮抑素分子量为20KD，结构由184个氨基酸残基构成，其中酸性氨基酸16个，碱性氨基酸29个，疏水氨基酸占42%，含4个半耽氨酸［3］。Sasaki等报道胶原蛋白XVIII的NCI结构域由N端联合区〔约50个氨基酸残基〕、中央蛋白酶敏感胶链区(约70个氨基酸残基)及C端稳定的内皮抑素结构域(约180个氨基酸残基)构成，胶原蛋白W in可能通过蛋白水解酶而裂解出内皮抑素［5］。内皮抑素作为血管抑制因子家族的一员，靶向血管内皮细胞，通过抑制内皮细胞增生和迁移，拮抗肿瘤的新生血管生成，从而阻断肿瘤的血液供应，使“饥饿”的肿瘤生长受到抑制，进入“休眠状态”并诱导凋亡［6］，在体外、体内试验中，均显示出强大的特异性抑制血管内皮细胞增殖的作用，进而抑制新生血管形成，从而抑制肿瘤的生长与转移［7,8］。
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