【摘要】 糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种慢性疾病，也是一种全球性疾病,糖尿病患者长期理想控制血糖有助于防止或延缓糖尿病肾病、神经病变和糖尿病视网膜病变等慢性并发症的发生,为了减少患者的痛苦和降低交叉感染发生的危险，人们想到了通过泪糖浓度这一无创指标来监测血糖控制情况的可能性，我们综合近年的相关研究进展，从泪液的特性及糖尿病患者的相关改变、不同收集方法对泪糖浓度的影响及检测泪糖浓度的产品等方面进一步探讨泪糖浓度作为糖尿病病情评价指标的可行性。
【关键词】 糖尿病；泪糖；收集方法
Research progress in tear glucose
JiaYing Tang, Jie Luan
Department of Ophthalmology, Zhongda Hospital, Southeast University,Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
Abstract
Diabetes mellitus(DM) is a kind of chronic and worldwide disease, and tight glycemic control is critical in manging DM and preventing complications such as nephropathy, neuropathy and retinopathy. In order to relieve DM patients pain and decrease the risk of crossinfection, noninvasive ways to monitor blood glucose concentrations are preferred, and one approach is to monitor glucose concentrations in tear fluid. This review covers recent understanding of features of tear fluid and relevant changes in DM, the influence of different collecting methods in tear glucose concentration, and attempts to monitor tear glucose concentration in situ by using contactlens based sensing devices.
KEYWORDS: diabetes mellitus; tear glucose; collecting method
0引言
糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种慢性常见病，也是一种全球性疾病,根据世界糖尿病联合会(IDF)2007年秋的报道，世界范围内，糖尿病患者已经达到2.46亿，并且预测到2025年，这个数目将达到3.80亿，目前我国糖尿病的发病率约为5%，人数仅次于印度居世界第二位[1]，糖尿病患者长期理想控制血糖有助于防止或延缓糖尿病血管、神经病变等慢性并发症的发生。美国糖尿病协会(ADA)建议，需要1d测量数次以了解血糖控制情况，并且对于注射胰岛素的患者来说，次数要相应增加[2]。目前基本还是通过血样本来了解血糖情况，为了减轻患者的痛苦，人们期望通过无创的方法来了解血糖值，在这一探索过程中，人们想到了将泪糖作为评价标准的可能性。我们将就目前针对泪液葡萄糖监测的相关研究做一综述。
1泪液的成分、泪膜的特性及糖尿病患者的相关改变
传统认为，泪液是主要由泪腺分泌的一种水样液体，有很少一部分来源于副泪腺及结膜的杯状细胞，通过瞬目运动覆盖在眼表形成泪膜[3]，但有研究表明[4]，来源于结膜的泪液流量可达到1～2μL/min,在基础泪液的产生中占到相当大的比例可达25%[5]，故用刺激性方法收集的泪液大多来源于泪腺分泌，而基础分泌的泪液中来源于结膜的占到了很大的比例。泪液的化学成分复杂，除水和电解质外，还有含氮物质、糖类、寡核苷酸、甾醇、有机酸、维生素、酶类和脂类，其中水分占98%～99%[6，7]。泪糖的浓度既由泪液中葡萄糖量的多少决定，同时泪液中水的比例也是一个非常重要的影响因素，进出泪膜的水的量的改变可对泪糖浓度有很大的影响，所以泪膜的结构和功能也是一个决定泪糖浓度的关键因素[8]，例如，在泪膜的最表层是一层100nm左右的脂质层，由睑板腺分泌的甾醇脂、蜡脂等组成，可起到防止下层水分蒸发及为角膜提供光滑光学平面的作用，如果睑板腺功能障碍，则会致泪膜中水分的蒸发增加，不仅会导致临床上的干眼，也会使泪液渗透压及泪液中的葡萄糖含量发生改变[9]。血糖的升高会造成糖尿病患者泪膜及泪液分泌量的改变。徐志刚等[10]报道，通过对2型糖尿病患者与无糖尿病的健康体检者分别行裂隙灯检查、眼底检查、角膜荧光素钠染色、泪膜破裂时间测定、Schirmer试验、球结膜印记细胞学等检查发现，糖尿病组主观症状、泪膜不稳定性及泪液分泌量的减少均高于正常对照组，印记细胞学结果显示糖尿病组结膜杯状细胞数减少，鳞状上皮化生明显，而杯状细胞数目减少是导致泪膜不稳定的主要因素。上述结果产生的机制尚未明确，Inoue等[11]认为糖尿病患者的糖代谢紊乱、周围神经病变导致泪腺和角膜神经功能障碍，同时周围神经病变还可以使角膜知觉减退，角膜上皮和基底膜异常，再生的上皮细胞黏附功能下降、角膜上皮缺损和脱落，从而致使泪液分泌量减少、泪膜稳定性下降。Ozdemir等[12]进行了糖尿病患者眼表改变的危险因素的研究，包括病程、糖尿病控制情况、糖尿病视网膜病变程度、氩激光视网膜光凝术，结果显示糖尿病控制不良、全视网膜光凝术、增生性糖尿病视网膜病变是导致2型糖尿病患者泪液功能不良的危险因素。
2泪液的收集方法
早在1930年，Ridley等[13]就第一次对泪液进行了定量研究，并报告根据0.2mL的样本量测得泪糖浓度为3.6mmol/L，之后随着检测设备的不断进步，要求的样本量不断减少，所报告的泪糖值也不断减小，最近LeBlanc等[14]报道选取了ICU的5例患者，每例患者取1μL的泪液，用液相色谱脉冲安培检测的方法测得泪糖为7.2±5.47μmol/L。两个实验结果有1000倍的差异。可见，选取不同的实验参数，如实验对象的选取，标本的收集方法，数据分析方法的不同，会对泪糖检测的结果产生影响。随着实验设备不断改善，先进的仪器技术如高压液相、质谱等检测方法已用于泪糖的测定使检测结果更加稳定、准确，因此探讨较多的是不同的标本收集方法对检测结果的影响，目前常用的收集泪液的方法包括机械刺激、化学刺激及非刺激性方法等。
2.1机械刺激 机械刺激取泪液的方法即用棉棒等刺激受检者结膜，并收集其反射性泪液，它的优点是在短时间内可以收集大量泪液，实验采集较方便，并且受检者的不适感较小，邱鸿士等[15]报道对36例确诊为糖尿病并且排除外眼疾病的实验组及32例无外眼疾病及血糖正常的对照组用手指翻动眼睑取研究对象的反射性泪液，用葡萄糖氧化酶法分别测定其泪糖和血糖浓度，结果显示在正常对照组，两者没有相关性，而在糖尿病组，两者有良好的相关性。Van Haeringen等[16]研究了不同收集方法对泪液中葡萄糖含量的影响，发现用滤纸收集的标本中葡萄糖的值要高于用毛细试管收集的，在血糖值低于10mmol/L的标本，前者的泪糖较后者高0.1～1.5mmol/L，在血糖高于20mmol/L的标本，两种收集方法间泪糖的差异更加显著，Van Haeringen等[16]等分析这种差异系对滤纸角膜和结膜上皮的机械刺激所致。Daum等[17]研究了物理刺激后，不同时间段泪糖值的变化，他们用棉花棒刺激非糖尿病患者结膜，而后在不同时间段用毛细玻璃管取5μL泪液，并测其中的泪糖，结果显示泪糖值在10min内，由刺激前的0.28mmol/L上升到刺激后的2.5mmol/L，在30min左右到达峰值，并在60min左右回到基线，提示机械刺激会使泪糖值升高，并提出实验取材过程中，无意识的或者不可避免的对结膜的机械刺激可能会影响后续的实验数据结果。同时，上述实验的统计结果表明，用物理刺激方法取泪液测得的泪糖值与血糖间有良好的相关性，但是有推测认为，这种方法取得的泪液基本都来源于结膜的反射性分泌而非基础分泌的泪液[8]，并且这种取材方法测得的结果在一段时间内较真实值偏高，在精确探索泪糖与血糖相关性的过程中，这种通过机械刺激收集泪液的方法已经被逐渐取代。
2.2化学和非接触性刺激 化学和非接触性刺激取泪液的方法是指将医用清凉油、风油精涂抹于受检者下睑皮肤，或者将受检者眼部暴露于刺激物，如洋葱蒸汽中，以收集泪液，这种方法可以在短时间内收集到大量泪液，并被广泛用于实验中。 李桂荣等[18]报道了用化学刺激的方法收集泪液，测出了糖尿病组和非糖尿病对照组泪糖值的显著差异，他们以50例无眼外疾病、血糖正常、无有关血糖影响因素的健康人及60例无眼外疾病的2型糖尿病患者为研究对象，通过以医用清凉油涂抹于受检眼的下睑皮肤的方法，获取反射性泪液，应用葡萄糖氧化酶法测其中的葡萄糖含量，结果显示正常人泪糖含量为0.14±0.07mmol/L，糖尿病患者泪糖含量为0.32±0.18mmol/L，两者比较差异显著（P<0.01），表明糖尿病患者的泪糖含量明显增高，提出泪糖测定可以作为筛选糖尿病的一个参考指标。另一方面，这种收集方法可能对检测出的泪液中的葡萄糖和其他成分的含量有所影响，有报道指出[19]，当泪液分泌增多时，其中的蛋白和钙的含量会降低，而钾的含量会增高，而且长时间暴露于催泪物中会使眼表的物理屏障受到破坏，从而使泪糖含量显著增高[8]，Christopher等[20]研究发现用洋葱刺激收集的泪液中葡萄糖较非刺激取的基础泪液的葡萄糖值高7～8倍；近期有报道指出[21]，催泪物的使用会使受检者揉拭眼睛的概率增加，而揉拭眼睛同泪液中的葡萄糖含量增加有明显的相关性；此外标本采集时间的不同亦会对结果产生影响，Daum等[22]报道将非糖尿病受检者的眼部暴露于洋葱蒸汽中20s，然后在2min时间内每隔20s取泪液测葡萄糖值，发现在2min时间内泪糖值从刺激前的平均0.3mmol/L降至刺激后的平均0.1mmol/L。提示上述因素皆对化学和非接触刺激方法收集泪液标本中葡萄糖的含量有很大影响。另外，用不同的化学或非接触方法收集泪液所测泪糖的结果之间的比较是困难的，因为不同的刺激方法可能对泪液成分产生不同影响，并且，标本的采集时间的不同可能会对结果产生影响，而准确统一的采集时间是很难控制的。
2.3非刺激性 随着收集的改进和检测方法的不断进步，十余微升甚至几微升泪液标本中的葡萄糖浓度都可以被检测到，于是人们开始尝试用非刺激性的方法收集泪液标本，这种方法收集的泪液基本为基础分泌的泪液，更加接近真实值，也更具有临床指导意义。这种收集方法通常是将一个有刻度的玻璃毛细管置于受检者外眦的泪膜处，并尽量避免接触结膜囊来收集标本，所收集的是基础分泌的泪液而非反射性泪液，基础泪液分泌约为1μL/min，所以收集5μL泪液可能需要5min甚至更长的时间。最早期的用非刺激方法收集泪液测其中葡萄糖浓度的实验是由Daum等[23]报道，他们收集了12例非糖尿病患者的875个泪液样本，测得其中葡萄糖浓度为0.42±0.356mmol/L，最近Lane等[24]报道用非刺激方法收集48例糖尿病患者和73例正常对照组的泪液5μL，用液相色谱脉冲安培检测的方法测量其中葡萄糖的含量，结果显示正常人的泪糖为0.16±0.03mmol/L，糖尿病患者的泪糖为0.35±0.04mmol/L，差异显著，具有统计学意义。Christopher等[20]报道用微量毛细管取标本1μL，以液相色谱质谱联用的方法测得泪糖值为13～51μmol/L，比较上述各实验结果，提示用同一种方法收集，不同的检测手段，不同的标本量可能对实验结果产生影响。不可否认的是，这种收集方法也是存在误差的，大部分报道的实验都要求标本量至少为5μL，也就是说标本收集时间为5min甚至更长，在这一过程中，完全避免刺激结膜、角膜，完全收集基础分泌的泪液是困难的，并且由于标本收集时间较长，泪膜表面泪液水分的蒸发亦可能影响其中的葡萄糖浓度。
3个体泪糖与血糖的相关性
近年来，已有很多关于泪糖与血糖相关性的报道，尽管运用不同的标本收集方法、检测方法，结论基本都显示泪糖与血糖有良好的相关性，泪糖可以作为一种评价糖尿病患者血糖控制水平的指标，但是在个体中，泪糖与血糖相关性的研究甚少。Christopher等[20]最近报道了这方面的研究，他们定时的收集参加葡萄糖耐量试验(口服75g葡萄糖)的健康对照组和糖尿病患者的泪液，收集过程中尽量避免刺激结膜，收集泪液量为1μL，并用液相质谱色谱联用的方法测量。结果显示，大多数个体在葡萄糖摄入之前，血糖和泪糖都是相对平稳的，在葡萄糖摄入之后，血糖和泪糖都有升高，并且相对于血糖，泪糖的升高要滞后20～30min。同时，在Christopher等[20]的实验中还比较了同一个个体左眼和右眼的泪糖浓度，发现同一个个体，在摄入葡萄糖以后，左眼的泪糖浓度升高了5倍，而右眼的泪糖浓度升高了60%，双眼泪糖升高的差异显著。而这一结论在他们早前的实验中亦有提及，Baca等[21]报道同时取受检者双眼泪液测泪糖浓度，发现在其中一些受检者双眼泪糖浓度的明显不同。目前，比较个体双眼泪糖浓度的报道并不多，其相关性和差异原因有待进一步研究，除生理因素外，目前考虑的影响因素有一些误差，收集泪液过程中刺激受检者结膜引起反射性泪液的分泌，还有连续收集过程中，受检者可能揉拭眼睛及了泪膜表面的水分蒸发皆会影响泪糖浓度[8]。
4新材料与检测设备
March等[25]首先报道研制出可用于临床的用于检测泪糖的角膜接触镜，通过角膜接触镜上荧光的强弱来了解泪糖的情况，当泪糖升高时，角膜接触镜上的荧光信号变会增强，虽然它并不能反应泪糖的具体数值，但是可以让糖尿病患者及医务工作者大概了解血糖的变化情况。Badugu等[2628]研制出一种无色的角膜接触镜，这种角膜接触镜内置有可溶于水的、含有荧光团的硼酸，由于硼酸的分子几何及其芳香族的特性，使其对葡萄糖十分敏感，当含有荧光团的硼酸与泪液中的葡萄糖发生反应时，可出现荧光反应，通过分光光度计测量吸收值可以了解泪液中葡萄糖含量。该研究的独特创新之处在于可检测到泪液中极低的葡萄糖浓度，但是这种角膜接触镜的一个缺点是需要外在的检测设备，目前Badugu等[26]希望通过开发研究一种有颜色的日抛型角膜接触镜，从而更加便捷地了解血糖控制情况，它的原理和无色角膜接触镜是一样的，不同的是荧光吸收色谱的改变在有色角膜接触镜上表现出不同的颜色，患者可以通过与色谱条的比对从而了解血糖控制情况，这种角膜接触镜使用起来更加方便。另外，Chu等[29]报道已研制出一种新型又简便的生物检测器，这种检测器主要由一个具有良好可塑性的过氧化氢电极和由磷脂聚合物及聚四氟乙烯等固定的葡萄糖氧化酶(GOD)组成，将检测装置的端电极与一个由电脑控制的恒电极相连，从而测量泪液中葡萄糖的含量。检测结果与0.05～1.00mmol/L的葡萄糖浓度具有良好的线性关系，相关系数达到0.999，从而提示可用于泪糖的检测。鉴于这种检测器具有良好的可塑性，Chu等[29]正进一步研究期望将其制成角膜接触镜实现泪糖的实时监测。
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