【摘要】 目的：研究辅酶Q10对紫外线致角膜上皮细胞光损伤的防护作用及其机制。方法： Wistar大鼠48只随机分为正常对照组、阳性对照组与辅酶Q10治疗组。紫外线照射建立角膜上皮紫外线光损伤模型。治疗组于光照前和光照期间每天辅酶Q10灌胃，共21d。阳性对照组每天给予等体积的生理盐水灌胃，正常对照组不给任何处理。紫外线照射第3次后12h处死动物取角膜，光学显微镜下观察各组角膜组织病理学改变，分光光度法测量角膜上皮组织的SOD，MDA的含量，并进行统计学检验。结果：角膜上皮紫外线光损伤后阳性对照组SOD水平下降，MDA水平升高，其差异与正常组比较有统计学意义（P<0.01）。与阳性组比较，治疗组SOD水平升高，MDA含量降低（P<0.05）。结论：辅酶Q10对角膜上皮紫外线光损伤具有保护作用，机制可能与清除自由基和增强抗氧化能力有关。
【关键词】 辅酶Q10；角膜上皮；紫外线；光损伤
Protective effect of coenzyme Q10 on ultraviolet irradiationinduced injury of rats corneal epithelium
ChunFeng Gou, Qin Liu, BaoAn Hao, LanPing Su, YaDong Wang
Department of Ophthalmology, the Rehabilitation Center Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Department of Ophthalmology, the Peoples Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Abstract
AIM: To explore the protective effect of coenzyme Q10 on ultraviolet (UV) irradiationinduced injury of rats corneal epithelium and its mechanisms.
METHODS: Fortyeight Wistar rats were divided randomly into normal control group, positive control group and coenzyme Q10 group. The UV irradiationinduced damage model of Wistar rats was established by exposing to ultraviolet. The rats in coenzyme Q10 group were intragastric administrated by coenzyme Q10 everyday for three weeks before and during UV exposure. The rats in normal group did not received ultraviolet light, and the rats from positive group only underwent ultraviolet ray without the administration of drug. Histopathologic changes were observed with light microscopy. The contents of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) in the corneal epithelium were measured by photometry. Statistical analysis was used to assess results.
RESULTS: After UV irradiationinduced injury, the content of MDA in positive control group was increased and activity of SOD was decresed obviously, which significantly differed from the normal control group (P<0.01). In contrast to the positive group, the content of MDA in coenzyme Q10 group was reduced and activity of SOD was increased (P<0.05).
CONCLUSION: Coenzyme Q10, by removing oxygen free radicals, elevating the ability of antioxidation in corneal epithelium, can protect corneal epithelium against UV irradiationinduced injury.
KEYWORDS: coenzyme Q10; corneal epithelium; ultraviolet; irradiationinduced injury
0引言
紫外线对角膜的损伤是眼科常见的一种损伤。紫外线对组织有光化学作用，能诱发自由基产生和脂质过氧化物的形成，主要通过凋亡[1]的形式导致角膜细胞的死亡和脱落，产生强烈的症状如异物感、刺痛、畏光流泪及眼痉挛。因此，对角膜紫外线光损伤防治的药物研究具有重要意义。本研究旨在利用紫外线消毒灯照射的方法建立紫外线光损伤的动物模型，并在体内应用外源性辅酶Q10，检测角膜上皮细胞内自由基清除剂超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD ）和脂质过氧化物反应产物丙二醇（malondialdehyde, MDA)含量的变化，探讨辅酶Q10对角膜的保护作用及其机制，以期为辅酶Q10在眼科领域的研究、应用提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1动物及分组 健康成年Wistar大鼠48只，体质量180～250g，雌雄各半，双眼无眼疾，由甘肃省中医学院实验动物中心提供。随机分为正常对照组、阳性对照组与辅酶Q10治疗组共3组，每组各16只。
1.1.2角膜上皮紫外线光损伤模型的制备 采用贺冰等[ 2]的方法，用波长在253.7nm紫外线灯管12只, 相隔15cm分别置于边长40cm正方形鼠笼中,底面的平均照射度3.6J/cm2 。10g/L戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，缝线开睑。紫外线连续照射各实验组大鼠眼部3d、每天5min。
1.2方法
1.2.1给药方案 辅酶Q10治疗组：辅酶Q10（上海衡山药业有限公司生产）于光照前经灌胃给药，1次/d，连续21d（灌胃期间的最后3d给予紫外线照射）。剂量为20mg/kg，药物用蒸馏水稀释至5mg/mL，灌胃前新鲜配制；阳性对照组：光照前经灌胃给予同样体积的生理盐水，1次/d，连续21d（灌胃期间的最后3d给予紫外线照射）。正常对照组：不给任何处理。
1.2.2取材及标本制备 所有大鼠断脊髓处死后取右眼全眼球，置于40g/L多聚甲醛中固定24h，取角膜组织。常规脱水、石蜡包埋、切片，做HE染色。分光光度法测量左眼角膜组织的SOD，MDA的含量。
1.2.3染色
1.2.3.1 HE染色 切片常规脱蜡，双蒸水水化，常规苏木精染色，盐酸乙醇分色，伊红染色，显微镜下观察并拍照。切片取角膜中央，以保证切片间的可比性。
1.2.3.2分光光度法测量角膜组织的SOD，MDA的含量 第3d紫外线照射大鼠眼部12h后，立即断脊髓处死动物，每组大鼠取左眼球。冰上操作，用直径3.5mm吸取200mL/L乙醇的圆形滤纸敷帖角膜中央20s，蒸馏水冲洗2遍，刮取角膜上皮。以分析天平称湿重，再用双蒸水配成20g/L的湿重，匀浆。将匀浆倒入试管中，3000r/min离心15min，取出上清液测量各指标。
统计学分析：采用SPSS 11.5软件包处理数据，实验中各项指标的所有数据均采用以均数±标准差（±s）表示，组间差异采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1形态学观察
2.1.1正常对照组 角膜上皮是由4～6层的非角化的鳞状上皮构成，细胞排列紧密，各层排列整齐，染色均匀，细胞形态规整。
2.1.2阳性对照组 可见角膜上皮层表层细胞脱离，形成空泡样，细胞层数减少，仅见1～2层上皮细胞。高倍镜（40倍）下可见细胞核浓染或核质碎裂贴边，出现核周空泡。前弹力层、基质层及以下结构均未见明显变化。
2.1.3辅酶Q10治疗组 角膜上皮各层细胞排列基本整齐，细胞形态基本规整，偶可见胞核浓染及核周空泡形成。各组的角膜组织均未发现白细胞或单核细胞浸润等炎症反应。前弹力层、基质层及以下结构均未见明显变化。
2.2 SOD，MDA的含量检测结果 角膜上皮紫外线光损伤后与正常组比较，阳性对照组SOD水平下降，而MDA升高，其差异与正常对照组比较，有统计学意义（P＜0.01）。与阳性组相比较，治疗组角膜上皮SOD水平升高，MDA含量降低（P＜0.05）。治疗组SOD水平、MDA含量与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01，表1）。
表1 3组大鼠角膜上皮SOD活力和MDA含量的比较（略）
aP＜0.05 vs治疗组；bP＜0.01 vs对照组。
3讨论
许多年来，人们对紫外线所致角膜光损伤的发病机制进行了许多研究，很多证据认为自由基连锁反应是造成组织损伤的核心环节。紫外线由角膜吸收，产生大量的氧自由基[3]。自由基是一种具有双向生物学效应的原子或分子集团。正常情况下，在线粒体内电子传递过程中形成少量O2，而细胞内自由基清除剂超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）能使O2转变为H2O2，后者又通过触酶及谷光甘肽过氧化物酶的作用还原为水和分子氧，故小剂量的自由基并不造成损伤。但在紫外线照射或其他因素情况下代谢失衡，自由基产生过多，机体内的自由基清除剂不足与之反应，导致多种氧化损伤则可引起组织的损伤。自由基[4 ]通过以下途径攻击细胞而至细胞死亡：（1）自由基攻击DNA碱基和DNA的双链结构、造成DNA不可修复的损伤；（2）抑制抗氧化酶,引发脂质过氧化反应，使生物膜中饱和与不饱和脂肪酸比例失衡。（3）使角膜上皮的Na+，K+ ，ATP 酶失活，导致细胞代谢障碍。紫外线辐射可以诱发角膜缘局部组织细胞中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，脂质过氧化反应中产生的自由基可与组织中的蛋白质分子相互作用，从而使细胞的酶系统失活影响细胞的代谢。由于自由基的化学性质活泼，可以扩散到生成部位以外的生物分子中，使之发生损伤。脂质过氧化物可使细胞膜的通透性增加，线粒体膨胀，溶酶体释放及酶失活，进而影响细胞功能[ 5]。紫外线辐射后引起的脂质过氧化物反应产物还可以导致细胞代谢障碍，抑制细胞的有丝分裂，使DNA解聚。同时，它们耗损了大量诸如SOD等抗氧化物质，使组织抗氧化能力下降。同时动物实验还证明了经紫外线照射后角膜上皮的丙二醇（malondialdehyde，MDA，脂质过氧化物反应产物）含量明显增加，SOD含量下降[ 6]，也证实了上述观点。因此，通过测定SOD和MDA的含量变化，就可以间接的反映组织过氧化损伤的情况。辅酶Q10，别名癸烯醌、泛醌，化学名为2，3二甲基5甲基6癸异戊烯基苯醌，是一种脂溶性醌类化合物，具有抗氧化、清除自由基、维持细胞结构完整等功能。辅酶Q10存在于线粒体内膜上, 既是生物体呼吸链中重要的递氢体，又是线粒体氧化磷酸化ATP形成所需的重要酶类的关键辅助酶，是天然抗氧化和膜稳定剂, 具有促进细胞氧化磷酸化、改善能量代谢等多种功能。因此，辅酶Q10已广泛应用于心血管及神经系统疾病的辅助治疗中，如充血性心衰、心绞痛、高血压病及帕金森病的治疗，并已取得一定成效[ 7]。我们通过组织形态学检查发现，阳性对照组可见角膜上皮层表层细胞脱离，形成空泡样，细胞层数减少，仅见1～2层上皮细胞。高倍镜（40倍）下可见细胞核浓染或核质碎裂贴边，出现核周空泡。而辅酶Q10治疗组角膜上皮各层细胞排列基本整齐，细胞形态基本规整，偶可见胞核浓染及核周空泡形成。SOD，MDA的含量检测结果显示：角膜上皮紫外线光损伤后与正常组比较，阳性对照组角膜组织中SOD活力下降，而MDA含量升高。与阳性组相比较，辅酶Q10治疗组角膜上组织中SOD活力升高，MDA含量降低。表明给予外源性辅酶Q10对光损伤后的角膜组织SOD活力和MDA含量有显著的影响。我们从病理形态学和生物化学的角度，证实辅酶Q10对角膜上皮细胞的紫外线光损伤具有保护作用，机制可能与清除自由基和增强抗氧化能力有关。
【参考文献】
1 Pauloin T, Dutot M, Joly F, et al. High molecular weight hyaluronan decreases UVBinduced apoptosis and inflammation in human epithelial corneal cells. Mol Vis 2009;15:577583
2贺冰,宋志扬,宋忆淑,等.人工模拟酶对紫外线造成眼前段损伤的保护作用.眼科研究 2002;20(5):395396
3 Lodovici M, Raimondi L, Guglielmi F, et al. Protection against ultraviolet Binduced oxidative DNA damage in rabbit cornealderived cells (SIRC) by 4coumaric acid. Toxicology 2003;184(23):141
4 Valko M, Izakovic M, Mazur M, et al. Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence. Mol Cell Biochem 2004;266(12):3756
5方允中.自由基与酶.北京:科学出版社 1989:6365,150168
6 Demir U, Demir R, Ilhan N. The protective effect of alphalipoic acid against oxidative damage in rabbit conjunctiva and cornea exposed to ultraviolet radiation. Ophthalmologica 2005;219(1):4953
7 Pepe S, Marasco SF, Haas SJ, et al. Coenzyme Q10 in cardiovascular disease. Mitochondrion 2007;7(1):154167
|
