【摘要】 目的：研究转化生长因子TGFβ2对体外培养人角膜内皮细胞(HCEC)增殖的影响机制。方法：体外培养经血清饥饿法获得同步化的HCEC，用不同浓度TGFβ2对HCEC进行不同时间的处理，采用细胞计数、MTT染色以及流式细胞仪(FCM)和Realtime PCR检测TGFβ2对HCEC的增殖、细胞周期及细胞中p27kip1和p21cip1表达的影响。结果：TGFβ2 1～15μg/L对HCEC有显著的增殖抑制作用，具有浓度和时间依赖性，9μg/L是TGFβ2抑制HCEC细胞增殖的峰浓度。9μg/L TGFβ2处理后，处于G1/G0期HCEC数量显著增加，并具有时间依赖性。9μg/L TGFβ2处理24h后， p27kip1表达量显著增加，48h后p27kip1和p21cip1的表达量均显著增加，也具有时间依赖性。结论：TGFβ2对HCEC具有显著的浓度和时间依赖性增殖抑制作用，可能通过先后诱导p27kip1和p21cip1表达量的增加将细胞拘留在G1/G0期来实现的。
【关键词】 人角膜内皮细胞;转化生长因子β2;增殖;抑制;细胞周期;p27kip1;p21cip1
Inhibitory effect of transforming growth factorβ2 on the proliferation of human corneal endothelial cells in vitro
TingJun Fan, Jing Wang, Jun Zhao, HongShou Yang, WenZhuo Zhao, XiuXia Yang
Foundation item:National High Technology Research and Development Program ("863" Program) of China (No. 2006AA 02A132)
Key Laboratory for Corneal Tissue Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, Shandong Province, China
AbstractAIM: To investigate the inhibitory effect of transforming growth factor (TGF)β2 on the proliferation of human corneal endothelial cells (HCEC) in vitro, and its cellular and molecular mechanisms.METHODS: Synchronized HCEC, prepared from in vitro cultured HCEC line by serumstarvation, were treated with TGFβ2 at different concentration for different time duration, respectively. After HCEC treated with TGFβ2, the inhibitory effect of proliferation, phase status in cell cycle, and expression of p27kip1 and p21cip1 of HCEC was examined by methods of cell number counting, MTT staining, flow cytometry (FCM) and realtime PCR, respectively.RESULTS: TGFβ2 at the concentration of 115μg/L had obvious inhibitory effects on HCEC proliferation in dose and timedependent manner, 9μg/L was the peak concentration of TGFβ2 for inhibiting HCEC cell proliferation. After treated with 9μg/L TGFβ2, the population of HCEC in G1/G0 phase increased obviously in timedependent manner. After HCEC treated with 9μg/L TGFβ2, the expression of p27kip1 increased obviously after 24 hours, and expression of p27kip1 and p21cip1 increased obviously 48 hours later in timedependent manner.CONCLUSION: TGFβ2 has obvious inhibitory effect on HCEC proliferation, and the inhibition is in dose and timedependent manner. The mechanism of TGFβ2 inhibition is most probably accomplished by inducing the in turn expression of p27kip1 and p21cip1 which keep HCEC rest on G1/G0 phase.
KEYWORDS: human corneal endothelial cells;transforming
0引言
角膜内皮细胞是存在于角膜中靠近于房水面的单层细胞，对维持角膜的透明有着关键作用。成年人角膜内皮细胞(HCEC)缺乏增殖能力，局部细胞受到损伤后，只能通过邻近细胞体积的增大和移行来填补缺损区[1]。G0/G1期HCEC仍有增殖潜能[2,3]。关于其丧失增殖能力的具体原因至今仍不清楚。转化生长因子β(TGFβ)属于TGFβ 超家族的成员，具有调控细胞的增殖、分化和凋亡等作用[411]。而TGFβ2主要存在于人房水中，可促进小鼠角膜上皮层和基质层的正常发育及内皮层的形成，抑制体外培养的兔和牛[4,5]角膜内皮细胞的增殖。有关TGFβ2对HCEC增殖和维持HCEC单层结构方面的影响及其调控作用，至今还未见到相关的报道。我们利用非转染人角膜内皮细胞系为体外研究体系，对TGFβ2对HCEC的增殖、细胞周期及p27kip1和p27kip1表达的影响进行研究如下。
1材料和方法
1.1材料
非转染人角膜内皮细胞(HCEC)系，由本实验室自行建立，取第100代细胞用100mL/L胎牛血清(FBS)DMEM/F12(1∶1)培养液在37℃，50mL/L CO2培养箱中进行培养;TGFβ2购自Peprotech公司，用含2g/L小牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(PBS)配制成10g/L的母液，分装后置80℃保存备用;MTT购自SigmaAldrich公司，用PBS配成5g/L的母液，经0.22μm微孔滤膜抽滤后分装，置4℃避光保存备用。表1Realtime PCR实验中所用的寡核苷酸引物序列(略)
1.2方法
将长满单层的HCEC用1.25g/L胰蛋白酶(含0.1g/L EDTA)消化处理，CASY细胞快速分析仪进行计数，混合均匀后，按照2.5×104个/cm2的细胞密度接种细胞到24孔培养板中，用100mL/L FBSDMEM/F12培养液在37℃ 50mL/L CO2培养箱中过夜培养后，将培养液更换为无血清DMEM/F12培养液，继续培养24h，获得饥饿后同步化到G1/G0期的HCEC。将培养液更换为含有不同浓度TGFβ2(1～15μg/L)的100mL/L FBSDMEM/F12培养液(每个浓度组设3个平行孔，180μL/孔)，继续培养72h后，加入5g/L MTT 20μL，37℃避光孵育4h， PBS冲洗1次后每孔加入二甲亚砜(DMSO)150μL，用BioRad公司的550型酶标仪测定490nm吸光，按照公式：抑制率=(1实验组平均吸光度/对照组平均吸光度)×100%，计算TGFβ2对HCEC增殖的抑制率，确定TGFβ2对HCEC增殖的峰值抑制浓度。使用TGFβ2的峰值抑制浓度按上述方法培养和处理细胞，每隔12h取3孔细胞进行MTT染色与测定，同法计算TGFβ2对HCEC增殖的抑制率，确定TGFβ2处理不同时间对HCEC增殖的影响。使用TGFβ2峰值抑制浓度处理的HCEC，于24，48和72h分别各取3瓶细胞，按上述胰蛋白酶消化法收集细胞， 1000r/min，离心10min漂洗后用700mL/L乙醇固定，PBS漂洗后用0.1g/L RNase A于37℃处理30min，经50mg/L碘化丙锭室温避光染色30min，200目筛绢过滤后，按照108个/L的细胞浓度用Beckman Coulter公司的Cytomics FC 500 MPL流式细胞仪及其配套软件对HCEC的细胞周期进行统计和分析。使用TGFβ2峰值抑制浓度处理的HCEC，于24，48和72h分别各取3瓶细胞，用Takara公司RNAisoTM Plus试剂盒提取总RNA，经Promega公司DNaseⅠ处理后，用Takara公司PrimeScriptTM试剂盒合成第一链cDNA，采用Takara SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒按照其操作指南对p21cip1与p27kip1进行Realtime PCR，目的基因和G3PDH内参基因的引物设计见表1，对PCR扩增产物通过熔解温度曲线进行特异性分析，对p21cip1和p27kip1的特异性表达进行检测。上述所有实验每组均设3个平行样品，用无TGFβ处理HCEC的平行样品作为阴性对照。
2结果
2.1 TGFβ2对HCEC增殖的影响
TGFβ2 1～15μg/L对HCEC的增殖抑制率具有一定的浓度依赖性，浓度为9μg/L时对HCEC的增殖抑制率达到峰值(图1)。9μg/L TGFβ2处理12h开始表现出对HCEC增殖的抑制作用(P<0.05)，随着处理时间的延长，其抑制率逐渐升高，至72h时TGFβ2对HCEC增殖抑制率可达到20.9%(图2)。
2.2 TGFβ2处理对HCEC细胞周期的影响
TGFβ2处理24～72h后G1/G0期HCEC数量比对照组显著增加(P<0.05)，且随着处理时间的延长比例逐渐增大，处理72h时比例可高达(83.4±0.7)%，比对照组增加(8.0±1.4)%(图3)。
2.3 p27kip1与p21cip1的表达
TGFβ2处理24h HCEC对p21cip1表达量与对照组相比没有显著差异(P>0.05)，而处理48和72h HCEC p21cip1表达量增加(P<0.05，图4A);TGFβ2处理24，48和72h HCEC p27kip1表达量与同期对照组相比均显著增加(P<0.05，图4B)。
[1] [2] 下一页 |
