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3讨论
足够的HCEC数量是维持角膜透明度、厚度和为角膜提供营养等正常生理功能的前提，但成人HCEC丧失了增殖能力，并以每年0.3%～0.6%的比例逐年减少。为了揭示TGFβ2对体外培养HCEC增殖的影响作用，我们采用血清饥饿法，即将培养液更换为无血清DMEM/F12培养液连续培养了24h，获得了同步化到G1/G0期的HCEC，进而研究了TGFβ2不同浓度及不同处理时间对HCEC增殖活性的影响。MTT染色结果显示，1～15μg/L TGFβ2均可抑制HCEC增殖，其峰值抑制浓度为9μg/L，该结果与在牛角膜内皮细胞中的研究结果相似[4]。9μg/L TGFβ2处理12h便表现出对HCEC增殖的抑制作用，其抑制率随着处理时间的延长而逐渐升高，处理72h对HCEC增殖抑制率可高达20.9%，表明TGFβ2对HCEC细胞的增殖抑制作用具有一定的浓度和时间依赖性。该结论与在牛角膜内皮细胞中的研究结果是相似的[5]。现有研究结果表明，成人HCEC之所以不再分裂是因为其被阻滞在G0/G1期[3,5]。为了揭示TGFβ2抑制HCEC增殖的机制，我们研究了TGFβ2对体外培养HCEC细胞周期的影响。流式细胞仪检测结果显示，TGFβ2处理24，48和72h C1/G0期细胞比例显著增加，而处于分裂期的细胞比例显著减少，表明TGFβ2对HCEC增殖的抑制作用是通过使其拘留在G1/G0期来实现的。该结论与在人[5]和猫中的研究结果是一致的。已有研究结果表明，TGFβ2对细胞增殖的抑制作用主要是通过在G1/G0期增加CDKI的表达量进而抑制细胞由G1期进入S期来实现的[7,8]。为了揭示TGFβ2抑制HCEC增殖的分子机制，我们又研究了TGFβ2对HCEC中p27kip1和p21cip1表达量的影响。Realtime PCR检测结果显示，HCEC经TGFβ2处理24h后p27kip1表达量开始逐渐增加，48h后p21cip1表达量才开始逐渐增加，表明TGFβ2处理HCEC后首先可诱导p27kip1表达量的增加，随后才能诱导p21cip1表达量的增加，二者相互配合可能是将HCEC拘留在G1/G0期的主要原因。该结论与他人的研究报道是一致的[6,8,9]，但我们关于TGFβ2引起HCEC中p21cip1表达量变化的报道尚属首次。
综上所述， TGFβ2对HCEC增殖抑制作用具有浓度和时间依赖性，其抑制机制可能是通过先后诱导p27kip1和p21cip1表达量的增加进而将HCEC拘留在G1/G0期来实现的。
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