作者：张磊 王 强 雷宁玉 任 莉 戴慧琴 作者单位：滨州医学院附属医院眼科 滨州市 256603
【摘要】 目的 探讨丝裂霉素C（MMC）对兔角膜准分子激光切削术（PRK）后角膜愈合、角膜上皮下混浊及转化生长因子β2（TGFβ2）表达的影响。方法 24只健康新西兰白兔（48眼）分两组行PRK手术，术后将浸有0.02% MMC的滤纸片放置在右眼角膜中央切削区（MMC组），将浸有平衡盐水（BSS）的滤纸片放置在左眼角膜中央切削区（BSS组）2 min后用150 ml BSS冲洗。同时设立正常对照组。观察角膜上皮愈合情况、角膜浅基质层角膜细胞数量和形态变化及角膜上皮下混浊；免疫组化检测正常对照组及手术组（MMC组和BSS组）术后1 d、1周、4周和12周 TGFβ2表达情况并作分析。结果 MMC组角膜上皮愈合时间为（3.0±0.69）d，对照BSS组为（3.0±0.71）d，两组差异无统计学意义（P＞0.05）；术后MMC组浅基质层内角膜细胞明显减少，两组差异有统计学意义（P＜0.05）；BSS组角膜上皮下混浊明显重于MMC组，两组差异有统计学意义（P＜0.05）；术后各时段BSS组TGFβ2表达多于MMC组。结论 MMC不会延长角膜上皮的修复时间，并减轻术后角膜上皮下的混浊；MMC减轻术后角膜上皮下混浊形成可能部分与其调节TGFβ2的表达有关。
【关键词】 准分子激光屈光性角膜切削术；丝裂霉素C；角膜上皮下混浊；转化生长因子β2
Effect of mitomycin C corneal wound healing,haze and expression of transforming
growth factorβ2 after photorefractive keratectomy in rabbits
ZHANG Lei WANG Qiang LEI Ningyu et al
Department of Ophthalmology,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603
【Abstract】 Objective To investigate the effect of mitomycin C corneal wound healing，haze and expression of transforming growth factorβ2 after photorefractive keratectomy(PRK) in rabbits.Methods Twentyfour New Zealand rabbits divided randomly into MMC group and BSS group underwent bilateral 193 nm excimer laser photorefractive keratectomy to correct 6.0 diopter of myopia. After surgery a filter soaked with 0.02%MMC was placed on the central ablation stromal bed in the right eye and BSS in the left eye for 2 minutes then irrigated with 150 ml BSS. The process of epithelialization was observed .Corneal haze was assessed biomicroscopically using Fantes scale. The number of superficial stromal keratocytes was counted and morphologic changes were observed. Expression of TGFβ2 was detected and analyzed by immunocytochemical method at 1 d,1 week,4 week and 12 week after surgery.Results Mean epithelialization time was （3.0±0.69）days in the MMC eyes and 3.0±0.71 days in the control BSS eyes(not statistically significant,P＞0.05).A remarkable reduction of keratocytes in the superficial stroma after surgery was observed in MMC group(P＜0.05).Corneal haze was more severe in BSS group than in MMC group. Expression of TGFβ2 in corneas had increased more in BSS group than in MMC group at all time.Conclusion MMC did not delay epithelialization and could lessen the development of haze after photorefractive keratectomy. The effect of MMC on inhibiting haze induced by PRK maybe mediated through the suppression of TGFβ2.
【Key words】 photorefractive keratectomy,mitomycin C,haze,transforming growth factorβ2
准分子激光角膜切削术（photorefractive keratectomy, PRK）是一种简单、安全和有效的治疗近视、远视和散光等屈光不正的方法［１，２］。但其在角膜愈合过程中产生显著的角膜上皮下混浊(haze)和屈光回退，从而限制了该术式的进一步应用［３］。准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratomilensis, LASIK）与PRK相比，具有术后反应轻，视力恢复快，屈光状态稳定，无haze，无明显疼痛等优势，成为世界的主流术式［４］。然而，LASIK同样也存在着不可避免的与角膜瓣相关的术后并发症以及继发性圆锥角膜，严重威胁眼的屈光功能和眼的完整性［５］。所以，近年来激光表面切削术重新得到重视，并针对如何利用丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）减轻术后haze及屈光回退展开了深入的研究，并取得了理想的成果［６～８］。但MMC如何抑制haze的形成，其机制仍然不明［９］。本研究旨在观察MMC对兔角膜PRK术后角膜愈合和haze产生的影响，并利用免疫组化的方法，通过分析转化生长因子β2（TGFβ2）和角膜细胞变化关系，探讨MMC抑制角膜haze可能机制，为在临床中更好的利用MMC提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：选择国际标准实验动物纯种新西兰大白兔27只（滨州医学院动物实验中心提供），雌雄不限，体质量2.5～3.0 kg，裂隙灯检查无眼前部病变。
1.1.2 主要试剂和仪器：MMC 2 mg/支，浙江海正药业股份公司生产；DME培养液（美国Gibco公司）；甘油（上海化学试剂二厂）；TGFβ2多克隆抗体（美国 Promega公司）；羊血清、生物素化抗兔IgG 、链霉亲和素生物素过氧化酶复合物（美国Maxim Biotech公司）；DBA（上海化学试剂二厂）；Scan2000型准分子激光治疗仪（美国雷塞公司）。
1.2 方法
1.2.1 实验分组:24只兔48眼，右眼为MMC治疗组（MMC组），左眼为平衡盐水（BSS）对照组（BSS组），另设3只兔6眼为正常对照组。
1.2.2 动物模型的建立:10%水合氯醛3 ml/kg体重腹腔注射麻醉动物，同时0.4%盐酸奥布卡因眼表面麻醉。由专人手术。校正-6.0 D，直径5 mm，深度约为100 μm。术后分别将直径6 mm浸有0.02%MMC及BSS的滤纸放置在右眼或左眼中央切削区2 min，然后立即用150 ml BSS冲洗，涂红霉素眼膏并遮盖双眼，待动物苏醒后去掉遮盖。双眼均给予氧氟沙星点眼，每天1次，直至上皮愈合。
1.2.3 活体裂隙灯显微镜观察:手术组所有兔眼术后1 d、1周、4周、12周检查角膜情况，记录手术组兔眼术后角膜上皮完全愈合时间；记录兔眼术后1周、4周、12周haze程度及分级。 haze分级（fantes分级） 0级：角膜完全透明；1级：仅在裂隙灯显微镜下仔细检查方能发现的细微混浊；2级：在裂隙灯显微镜下较易发现的细微混浊；3级：中度混浊，通过混浊的角膜看不清虹膜的细节；4级：重度混浊，角膜混浊遮挡眼内的结构。
1.2.4 标本制作
1.2.4.1 角膜切片标本制作:分别于手术后4 h、1周、4周和12周采集动物角膜，常规包埋切片，备HE染色及免疫组织化学染色。
1.2.4.2 HE染色:在300倍光学显微镜下，对手数组和对照组选取角膜中央手术区仅靠上皮下1/4基质，测定基质浅层成纤维细胞数量。每份标本取3张切片，每张切片取5个测定区，计算平均值，结果以x±s表示。
1.2.4.3 免疫组织化学染色步骤：将标本常规脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化酶活性，正常山羊血清封闭。加一抗为1∶400稀释的TGFβ2单抗50 μl。加二抗：取出切片后，室温放置20 min，0.1 mol/L PBS洗5 min，共3次，加二抗50 μl，室温孵育10 min，0.1 mol/L PBS洗5 min共3次。加链霉素抗生物蛋白过氧化酶溶液，滴加三抗，室温孵育10 min，0.1 mol/L PBS洗5 min，共3次。DBA显色。苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光镜下观察结果。阴性对照采用PBS代替一抗。免疫组织化学染色结果判定：以胞质出现棕黄色染色为阳性。
1.3 统计方法 应用SPSS13.0统计软件处理。秩和检验计算haze程度比较、角膜上皮愈合时间，t检验用于免疫组化分析。
2 结果
2.1 裂隙灯显微镜观察
2.1.1 角膜上皮愈合情况:两组角膜愈合时间相似，见表1。MMC组平均愈合时间为（3.0±0.69）d（范围2～4 d），对照BSS组为（3.0±0.71）d（范围2～4 d），两组差异无统计学意义（P＞0.05）。表1 各组角膜上皮愈合时间分布
2.1.2 haze情况:两组均于术后1周左右出现haze，至4周时达到高峰，以后逐渐减退。术后4周与术后1周、12周进行组内比较，差异有统计学意义；两组术后各时间段内haze分级分布比较，除1周时两组haze程度差异无统计学差异外（P＞0.05），其余时间段差异均有统计学意义。见表2。表2 Haze等级分布表
2.1.3 光镜检查基质角膜细胞数量 正常对照组角膜浅层1/4基质细胞数目为（89.3±8.6）个。术后1 d，MMC组和BSS组浅层角膜细胞较正常对照组均下降，且MMC组下降较BSS组明显，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）；术后1周，MMC组和BSS组浅层角膜基质细胞均较术后1 d时增多，但仍低于正常对照组，MMC组角膜基质细胞数量低于BSS组，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）；术后4周，BSS组角膜基质细胞数目继续增多，并超过正常对照组，两组差异具有统计学意义（P＜0.05），MMC组增长不明显，仍低于正常对照组，与BSS组的差异具有统计学意义（P＜0.05）；术后12周，MMC组角膜基质细胞数目轻度增多，仍低于正常对照组，BSS组角膜基质细胞数目减少，基本与正常对照相等，MMC组与BSS组差异仍具有统计学意义（P＜0.05），见表3。表3 BSS组、MMC组术后不同时间角膜前1/4 基质内平均细胞数量对比
2.1.4 免疫组化结果 免疫组化染色发现正常对照组角膜上皮及基质内角膜细胞均有极少量TGFβ2表达；术后4 h，BSS组、MMC组均见TGFβ2表达增多；术后1周，BSS组、MMC组均见TGFβ2表达较术后4 h增多，BSS组表达较MMC组表达强烈；术后4周，BSS组TGFβ2无明显变化，MMC组表达较1周时轻度降低；术后12周，BSS组TGFβ2同术后4周，MMC组TGFβ2表达再次降低，见图1。
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