| 关键字：角膜炎
近年来我国真菌性角膜炎的发病逐年上升 ,聚合酶链反应 ( PCR)技术为真菌病原体检测提供了一条快速、 敏感的诊断方法。 真菌细胞壁较厚不易裂解 ,传统的 DNA提取因其繁琐而成为该技术应用于临床的障碍。本实验使用几种不同的裂解液提取常见角膜致病真菌 DNA,并将结果进行比较分析。
一、 材料和方法
1 .标准菌株:腐皮镰孢菌、 串珠镰孢菌、 禾谷镰孢菌、 木贼镰孢菌、 烟曲霉菌、 黄曲霉菌、 黑曲霉菌、 新月弯孢菌、 牵连青霉菌等均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。
2 .试剂: S DS(十二烷基硫酸钠 )裂解液、 CT AB (溴化十六碳烷基三甲胺 )裂解液、 Trit on2 x100裂解液、 异硫氰酸胍裂解液等均由华美生物工程公司提供。
3 .真菌 DNA的提取:少量标准菌株置于 015 ml双蒸水中。振荡混匀 , 3 000 r /min离心 1 min,取上清液 ,双蒸水稀释至 100倍。(1)异硫氰酸胍法: 200μl裂解液中加入 100μl菌丝稀释液 , 65℃ 水浴 15 min, 5 000 r/min离心 10 s。加入等量异丙醇 ,振荡混匀 , 14 000 r /min离心 10 min弃上清液。加入冰冷 75%乙醇 500μl洗 , 14 000 r/min离心 5 min,弃上清液 , 94℃ 烘干。加 30μl TE溶液。(2) S DS法: S DS裂解液 500μl,加入 100μl菌丝稀释液 , 94℃水浴 15 min。加入乙酸钾 150μl振荡混匀 , 13 000 r /min离心 1 min。取上清液重复以上离心。再次取上清液加入等量异丙醇 ,振荡混匀 , 13 000 r /min离心 2 min,弃上清液。加冰冷 75%乙醇500μl洗 , 13 000 r /min离心 1 min,弃上清液 ,烘干。加 30μl TE溶液。(3) CAT B法[ 3 ]: CAT B裂解液 500μl,处理过程同异硫氰酸胍法。 ( 4) Trit on2 x100法: Trit on2 x100裂解液200μl,加入 100μl菌丝稀释液 , 94℃水浴 15 min, 13 000r /min离心 2 min。(5)碱裂解法: 100μl菌丝稀释液中加 200μl 014 mol /L NaOH溶液 , 94℃ 水浴 20 min。加入 014 mol /L盐酸溶液 200μl,振荡混匀 , 14 000 r /min离心 5 min。
4 . PCR检测:所用引物:正链 5′ 2tcc gta ggt gaa cct gcg g23′ ,反链 5′ 2tcc tcc gct tat tga tat gc2 3′ 。 可扩增所有真菌 ,并且特异性好。反应体系及参数参考有关文献。取扩增产物 10μl,用含有溴化乙啶的 2%琼脂糖凝胶电泳 ,紫外观察特异性条带。
5 .灭菌刮片刀采集 57份镜检确认真菌感染的角膜刮片标本 ,在加入 100μl生理盐水离心管中濯洗刮片刀 ,振荡混匀离心管 , 3 000 r /min离心 1 min。取上清液 ,根据以上试验结果 ,选择较佳的裂解液提取标本 DNA进行 PCR检测。
二、 结果
1 .异硫氰酸胍法: 9种真菌全部在 PCR体系中扩增出目的片段 ,条带较亮。
2 . CAT B裂解法: 9种真菌全部扩增出目的片段 ,曲霉菌、 青霉菌、 弯孢菌的条带亮度比异硫氰酸胍法减弱。
3 . S DS裂解法: 9种真菌全部扩增出目的片段 ,镰刀菌条带亮度弱于异硫氰酸胍法。
4 . Trit on2 x 100法:黑曲霉菌无条带出现 ,镰刀菌和青霉菌扩增产物条带亮度比异硫氰酸胍法暗。
5 .碱裂解法:仅有腐皮镰孢菌扩增出较弱的片段。
6 .异硫氰酸胍裂解液提取临床标本 DNA, PCR扩增 56份呈阳性结果并且条带较亮。
三、 讨论
有效获取目的 DNA是 PCR技术应用于临床病原体检测的关键。临床角膜刮片标本量少 ,难以开展试验 ,故我们采用标准菌株菌丝稀释液模拟临床标本来探索有效的真菌DNA提取方法。
异硫氰酸胍是一种强力秩序扰乱剂 ,可以裂解真菌释放DNA,试验证明该裂解液优于其他 4种提取方法。S DS法需反复离心吸取上清液 ,易损失 DNA,并且 S DS强烈抑制 PCR扩增反应 ,操作不慎会出现假阴性结果。CT AB可有效裂解真菌释放 DNA,并且对 PCR扩增无抑制作用 ,但 CT AB裂解法产物条带亮度弱于异硫氰酸胍法。
Trit on2 x 100法虽然操作简便 ,但对真菌效果有限 ,不宜选用。碱裂解法实际效果很差 ,后经检测上清液 pH值 ,发现变化较大 (2～11之间 ) ,从而影响 PCR反应。
临床标本的处理检测结果 ,也证实了异硫氰酸胍裂解液的可靠性。并且它操作简便、 用时少 ,易临床推广使用。最终确定异硫氰酸胍裂解法作为较理想的标本处理方法。|
作者:杨潇远 王丽娅 李振勇 李智涛 屈超义 孙声桃 |
