【摘要】 目的：观察光凝后即刻玻璃体腔内注射曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)对BN大鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)生长的抑制作用机制。方法：健康BN大鼠36只随机分为两组，随机抽取一眼作为实验眼。建立BN大鼠CNV动物模型。光凝后的即刻行玻璃体腔内注射TA 8μL(320μg)，对照组则在光凝眼行玻璃体腔内注射BSS 8μL。分别在光凝后1，2，4wk各处死动物6只，摘除眼球，制作石蜡切片，利用光镜观察不同时间点的CNV的变化。利用免疫组化的方法对NFκB，MCP1和FⅧRAg蛋白的表达进行半定量检测，并用原位杂交法检测VEGF的基因表达，并行半定量检测。结果：实验1，2，4wk，与对照组相比NFκB，MCP1和FⅧRAg蛋白表达及VEGF的基因表达明显降低(P<0.05)。结论：TA能够降低NFκB，MCP1等的表达和VEGF的转录，故TA是治疗CNV的一种有效的药物。
【关键词】 曲安奈德;脉络膜新生血管;核因子κB;单核细胞趋化蛋白1;血管内皮生长因子;Ⅷ因子相关抗原;积分光密度
Triamcinolone acetonide suppress CNV growing of BN rat
XiaoYan Gao1, ShouZhi He2
1Department of Ophthalmology, North Industry University Hospital, Beijing 100144, China;2Department of Ophthalmology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
AbstractAIM: To observe the inhibition of krypton induced choroidal neovascularization (CNV) of brown norway (BN) rat by intravitreal triamcinolone acetonide(TA) injection after photocoagulation, and to study the mechanism of inhibition of CNV growth.METHODS: Thirtysix healthy BN rats were divided randomly to two groups, one eye was chosen randomly as experimental eye. After establishing BN rat CNV model, 8μL(320μg) TA was injected in vitreous immediately after photocoagulation in treatment group, the same volume isotonic balanced salt solution (BSS) was injected in vitreous in the contrast group. Eyes of 6 BN rats were enucleated for histological slices in 1 week, 2,4 weeks. The protein expression of nuclear factorkappa B (NFκB), monocyte chemoattractant protein1(MCP1), factorⅧrelated antigen(FⅧRAg)was examined by immunohistochemical method, and the transcription of vascular endothelial growth factor mRNA(VEGFmRNA) was Examined by in situ hybridization, meanwhile semiquantitative analysis was conducted.RESULTS: In treatment group, the positive stain optical density of NFκB, MCP1, FⅧRAg, and VEGFmRNA was obviously lower the contemporaneous control group(P<0.05).CONCLUSION: TA can lower the expression of VEGF mRNA transcription and the protein expression of NFκB, MCP1 and FⅧRAg, so it can effectively inhibit the development of BN rat CNV, which indicats that TA is an effective drug to treat CNV.
KEYWORDS：triamcinolone acetonide; choroidal neovascularization; nuclear factorkappa B; monocyte chemoattractant protein1; vascular endothelial growth factor; factor Ⅷrelated antigen; integrated optical density
0引言
人们对湿性ARMD所致的CNV的治疗方法做了大量临床和实验研究,目前尚无确切疗法，主要有激光光凝、玻璃体手术切除CNV和放射治疗。这些方法不可避免地有损伤健康组织的潜在危险。药物治疗方法如皮质类固醇[1]、抗血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶抑制剂、脱氧氟尿嘧啶核苷和烟曲霉素类似物等正逐渐引起人们关注，其疗效有待进一步临床观察。我们仅采用光凝后即刻BN大鼠玻璃体腔内注射曲安奈德(TA)的方法来探讨该药对激光光凝诱导的CNV的发生发展的抑制作用及机制。
1材料和方法
1.1材料 氪激光机(美国Coherent公司，型号Novua 2000);Topcon OMS300型眼科手术显微镜;微量进样器(25μL)(上海安亭微量进样器厂);ImageProPlus 5.1图像分析系统(美国Media cybernetics公司)。TA注射液(1mL:40mg)(昆明积大制药有限公司);兔抗人FⅧRAgmAb(北京中杉金桥生物技术有限公司);兔抗大鼠MCP1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);小鼠抗大鼠的NFκBmAb 0.1mL(北京中杉金桥生物技术有限公司);即用型SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);SP9002免疫组化染色试剂盒;VEGF原位杂交检测试剂盒。
1.2方法 健康雄性BN大鼠36只，体质量200～220g，随机分为两组，实验组和对照组。复方托品酰胺滴眼液双眼散瞳，左下ip 100g/L水合氯醛溶液3.0mL/kg麻醉，检查双眼前节和眼底均正常。随机选取1眼作实验眼，滴10g/L甲基纤维素后，依照赵世红等[2]的方法建立CNV动物模型，另1眼不光凝为正常眼。全身麻醉状态下，丁卡因滴眼液表面麻醉后，手术显微镜下，30G针头颞侧角膜缘后0.5mm作一穿刺口，微量注射器从穿刺口进针，大约为1.5mm深，针尖朝向视神经方向，玻璃体中可见针尖，缓缓注入TA 8μL(320μg)，由散大的瞳孔可观察到玻璃体中TA的白色混悬液体，轻轻拔针后，显微镊子轻夹穿刺口片刻，以利穿刺口闭合。对照组BN大鼠玻璃体内注射同样容量的等渗的BSS液。因注射造成晶状体损伤的眼均被排除实验。光凝后在 1，2，4wk观察各实验指标，每组大鼠6只。深度麻醉下摘除眼球，DEPC处理过的蒸馏水冲洗，置于40g/L PFA0.1mol/L PBSDEPC液中固定2h。按病理组织学方法梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋，蜡块4℃保存备用。眼球组织5μm厚度连续切片，置于50℃ DEPC处理过的蒸馏水中展片，捞片，置烤箱37℃烤片12h后，4℃保存，备用做HE染色、免疫组化及原位杂交检测。
1.2.1 MCP1，NFκB及FⅧRAg表达的检测 石蜡切片，常规脱蜡至水;30mL/L H2O2室温孵育10min，阻断内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min;切片置于盛有0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液的抗原修复盒中，微波中火加热15min进行抗原微波炉热修复，自然冷却30min;滴加50g/L BSA封闭液，室温20min。滴加一抗兔抗大鼠MCP1多克隆抗体(1∶70)，4℃过夜;滴加生物素化山羊抗兔IgG(二抗)，37°C孵育20min;滴加SABC，37°C孵育20min;滴加AEC，室温显色，镜下控制反应时间(3～10min)，蒸馏水充分洗涤;苏木素轻度衬染10s，自来水充分水洗，水溶性封片剂封片。另组织切片脱蜡至水，滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15min;滴加一抗小鼠抗大鼠的NFκBmAb(1∶70)，4℃过夜;滴加生物素化二抗-生物素标记山羊抗小鼠IgG，室温孵育15min;滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育40min;余同MCP1。另抗原修复采用滴加1g/L胰酶消化液，室温10min;滴加50g/L BSA封闭液，室温20min;滴加一抗兔抗人FⅧRAgmAb(1∶100)，4℃过夜;余同MCP1。用0.01mol/L PBS取代一抗孵育，作为阴性对照，试剂盒中已知阳性切片作为阳性对照。切片内被染成红色的点、团簇为阳性反应物。
1.2.2 VEGF表达的检测 石蜡切片常规脱蜡至DEPCH2O;30mL/L H2O2室温10min，灭活内源性酶;切片上滴加30g/L胃蛋白酶室温消化10min，暴露mRNA片段;滴加预杂交液20μL，于含200mL/L甘油20mL的杂交湿盒中40℃预杂交3h;滴加含VEGF寡核苷酸标记探针的杂交液20μL，原位杂交专用盖玻片盖在玻片上，置湿盒中于42℃杂交18h;滴加封闭液，37℃ 30min;滴加生物素化鼠表1 FⅧRAg，VEGFmRNA表达的变化(±s,n=6)表2 NFκB和MCP1的变化(±s,n=6)
抗地高辛，37℃孵育1h;滴加SABC，37℃孵育30min;生物素化过氧化物酶37℃孵育20min;AEC室温显色，镜下控制反应时间;苏木素复染20s，充分水洗，GVA水溶性封片剂封片。呈团簇、点状的红色着色为阳性。用不含探针的杂交液进行杂交作为阴性对照，试剂盒中已知阳性切片作为阳性对照。应用ImagePro Plus 5.1图像分析系统(美国Media cybernetics公司)对NFκB，MCP1和FⅧRAg的阳性着色光密度、VEGFmRNA阳性着色光密度进行半定量分析。每例标本400倍光镜下，选取连续切片中含有最大CNV直径的切片，对细胞因子的蛋白及基因表达阳性着色光密度进行IOD测量，取平均IOD值作为1例标本的观察值，每个观察时间点，均为6个实验动物。
统计学分析：所得数据均用±s表示。应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理，分析组内差异的显著性用单因素方差分析，两两比较用SNK检验，同一时间内的组间比较用Student t检验。
2结果
2.1 FⅧRAg和VEGFmRNA表达的变化 用药组FⅧRAg蛋白表达随时间呈逐渐增加的趋势，早期为微量的点状的FⅧRAg的蛋白表达，1wk与2wk之间无统计学差异，在4wk时表达略增加，与2wk时相比具有统计学差异(P<0.05);同一时间内两组之间相比具有显著的统计学差异(P<0.05，图1)，可见在对照组的CNV组织中的FⅧRAg大量表达，并且随CNV生长其表达大大增加，逐渐围成管腔状(图1A′，B′)。VEGFmRNA的表达在用药组的CNV中较低，在1，2wk时有微弱的点状阳性着色，在4wk时增加，且与2wk相比有显著的统计学差异(P<0.05)，但均显著地低于同时期对照组的VEGFmRNA的表达(图2A，B，P<0.05)。
2.2 NFκB和MCP1表达的变化 用药组NFκB的表达随时间呈逐渐增加的趋势，CNV形成不明显(图3)，但在4wk时间内NFκB的表达组内无明显差异;对照组中NFκB的表达呈增加的趋势(P<0.05)，同时期内两组之间相比具有显著的统计学差异(P<0.05，图3)。MCP1的免疫组化检查显示：在4wk时间内，用药组的MCP1蛋白表达随CNV的生长而逐渐增强(P<0.05)，但与同时期的对照组相比具有显著的统计学差异(P<0.05)，用药组蛋白表达远远低于对照组。
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