【摘要】 目的：研究肿瘤特异性双自杀基因载体pcChCDTK对人视网膜母细胞瘤Y79细胞的体外杀伤作用。方法：将双自杀基因载体pcChCDTK电转染Y79细胞株。通过RTPCR和 Western blot方法确定CDTK在体外培养的细胞中表达情况。用HPLC法测定转染Y79细胞中5FC向5FU的转化效率。向载体转染和未转染的Y79细胞中加入不同浓度的前体药物5FC(0，25，50，100，200，400，800mg/L)和/或GCV(0，2，4，8，16，32，64mg/L),5d后用MTT法检测Y79细胞的平均存活率。结果：双自杀基因载体pcChCDTK电转染Y79细胞成功：在载体转染的Y79细胞中，RTPCR扩增出长度为403bp的特异条带，Western blot检测见一59kD大小的条带，与CDTK基因序列分析的预期结果一致。双自杀基因载体系统致Y79细胞存活率降低：转染Y79细胞中，5FC向5FU转化的效率为84.5%。转染和未转染Y79细胞中加入5FC或GCV后平均细胞存活率均随浓度增加而降低，两组比较当5FC浓度达到100mg/L,GCV浓度达到8mg/L后各对应浓度组间均存在差异(P<0.05)。转染组间比较，当5FC达200mg/L,GCV达16mg/L后，5FC+GCV组平均细胞存活率低于单加5FC或GCV组，有统计学差异(P<0.05)。结论：双自杀基因载体pcChCDTK转染Y79细胞后，在Y79细胞被转录和翻译成CDTK双自杀基因蛋白。给予5FC和GCV达到一定浓度时，它们转化成细胞毒性物质对Y79细胞产生杀伤作用。双前体药物的杀伤作用大于单前体药物。
【关键词】 CDTK基因;视网膜母细胞瘤;自杀基因治疗;5FC;GCV
Killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on Y79 cells in vitro
YongHong Zhang1，LuoSheng Tang2
1Department of Ophthalmology,the Peoples Hospital of Liuzhou City,Liuzhou 545006,Guangxi Zhuang Autonomous Region,China; 2Department of Ophthalmology，the Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410011，Hunan Province，China
Correspondence to：YongHong Zhang.Department of Ophthalmology,the Peoples Hospital of Liuzhou City,Liuzhou 545006,Guangxi Zhuang Autonomous Region,[email protected]
Received:20100726 Accepted:20100812
Abstract
AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.
METHODS:At first,the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC,GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.
RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis,there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P<0.05).The survival Y79 cells treated with 5FC and GCV was lower than 5FC or GCV.
CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.
KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV
Zhang YH, Tang LS. Killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on Y79 cells in
vitro. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) 2010;10(9):16681671
自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一，也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一。构建安全高效的载体是基因治疗的关键。我们已经成功的构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK[1]。我们将探讨该载体对人视网膜母细胞瘤Y79细胞在体外的作用。
1材料和方法
1.1材料
Y79细胞株[美国模式菌种收集中心(ATCC)];RPMI1640细胞培养基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC，5FU,GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL试剂盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);双丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白质Marker(上海生化试剂公司);实验所用引物 (上海生工生物工程有限公司)：yCDrt：5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt：5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F：5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R：5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。
1.2方法
将经过证实的含有pcChCDTK质粒的JM109菌液0.2mL接种到200mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃,280r/min的摇床上培养16h，将菌液转移到离心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步骤进行操作提取质粒pcChCDTK,干燥后，加无菌水溶解质粒300μL，用Duc 640分光光度计测定DNA含量，20℃分装保存。用RPMI1640培养液培养Y79细胞，每日在倒置相差显微镜下观察。Y79细胞悬浮生长，培养中细胞可聚集成团并沉集于培养瓶底部，当细胞基本铺满瓶底即可传代，按照1∶2～1∶4传代。将传代后的Y79细胞培养24h后，细胞进入对数生长期，即可用于电转化。未转染Y79细胞生长迅速，传代后培养24h后，细胞进入对数生长期。取上述进入对数生长期并基本铺满瓶底的细胞，在22℃,1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞。用0.01mol/L PBS 10mL重悬细胞，取细胞悬液20μL，用细胞计数板计数，其余细胞在22℃，1000r/min条件下，离心10min，重新收集细胞;根据计数结果，用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重悬细胞。取800μL细胞重悬液加入到含有pcChCDTK质粒20μg的EP中，吹打混匀，然后转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，迅速将电击产物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液的75cm2培养瓶中，置37℃,50mL/L CO2的细胞培养箱内培养。电转染后的Y79细胞生长与未转染细胞相似。倒置相差显微镜下见细胞悬浮生长，形状饱满，色泽鲜亮，聚集成团。
1.2.1 CDTK基因表达的检测
提取Y79细胞RNA;参照reverse transcription system kit进行RTPCR反应;取逆转录产物2μL作为模板，以yCDrt和TKrt为引物扩增CDTK，同时用βactin扩增引物作对照，RTPCR产物用8g/L琼脂糖凝胶跑胶检测。另取未转染的Y79细胞设为对照，同法处理。取转染48h和未转染的Y79细胞预处理;固定玻片;配制分离胶和堆积胶;上样;跑胶;转膜;封闭;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;显色;曝光。
1.2.2 5FU浓度的检测
人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃,50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。细胞在转染肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满瓶底。将细胞在22℃,1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞，用适当体积的无血清的RPMl1640培养液重悬，细胞计数，使之密度为6.25×109/L。取细胞悬液800μL加入自杀基因载体pcChCDTK 20μg，将其混匀，转入0.4cm的电击杯中，以2kV,25μF的条件进行电击。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后收集细胞并用1×PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个细胞的浓度植入24孔板，每孔培养液体积1mL。24h后加入前体药物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其细胞上清，用高效液相色谱仪(HPLC)检测其5FU的浓度。配5FC及5FU标准品的浓度梯度做标准曲线。LC10A高效液相色谱仪;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm,150mm×4.6mm,ID);预柱YWGODS(10μm,10mm×4.6mm,ID);流动相：甲醇/水(20/80);流速1mL/min;检测波长266nm;柱温37℃。10μL进样。
1.2.3前体药物对细胞毒性的检测
采用Western Blot技术检测新融合自杀基因CDTK在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的蛋白质水平表达。人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃,50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。以2×105个细胞的密度将细胞接种到96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后，加入不同浓度的前体药物100μL，即5FC以0，25，50，100，200，400，800mg/L;GCV以0，2，4，8，16，32，64mg/L加入96孔板。每个浓度梯度有4孔。留1孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。在37℃,50mL/L CO2的条件下，细胞不换液培养5d后，每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL，37℃，继续孵育4h，终止培养，吸去培养上清液。每孔加入DMSO 150μL，振荡10min，使结晶物充分溶解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔吸收值。以每天进行换液的细胞做对照，假设细胞存活率为100%，将其它各细胞孔的吸收值与其比较得出各处理组细胞的平均存活率。另视网膜母细胞瘤细胞在转染前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满培养瓶底。将pcChCDTK载体电转染Y79细胞。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后，收集细胞并用0.01mol/L PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个的密度植入96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后加入不同浓度的前体药物100μL，5FC+GCV以两药的对应浓度加入96孔板，每个浓度梯度有4孔。留一孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。然后用MTT法检测细胞存活率。统计学分析：所得数据用SPSS 11.5统计软件包进行统计，采用StudentNeuman Keuls(SNK)检验，以P<0.05为统计学上具有显著性差异。
2结果
2.1 Y79细胞转染后CDTK基因的表达
RTPCR检测结果显示，转染组可见一403bp特异条带，与预期大小一致(图1)。而在未转染的对照组细胞中，未扩增出403bp特异条带。在两组中均扩增出作为内对照的βactin产物561bp条带。分析结果显示：大小为42kD的内参βactin蛋白条带在转染和未转染的Y79细胞中均可见，一个大小为59kD的条带，在转染了pcChCDTK载体的Y79细胞中可见，这与yCDTK基因序列分析的预期蛋白大小一致，为自杀基因yCDTK蛋白。未转染pcChCDTK的Y79细胞中则没有59kD的条带出现(图2)。
2.2 Y79细胞转染后5
FC转化效率 加5FC 24h后上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，5FC向5FU的转化效率约为84.5%。
2.3前体药物对Y79细胞的毒性
将生长良好的人视网膜母细胞瘤Y79细胞，按每孔2×105个细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为98.2%,94.7%,90.5%,88.2%,89.4%,86.4%和83.9%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P<0.05)，表明5FC对Y79细胞有低微毒性。加入不同浓度的前体药物GCV培养5d后，平均细胞存活率分别为96.2%,95.2%,93.5%,93.3%,83.4%,68.9%和59.9%。SNK统计分析表明后3个数据与前4个数据有显著性差异(P<0.05)，表明高浓度的GCV对Y79细胞有较强的毒性作用，浓度越高毒性越大。
2.4前体药物对用肿瘤杀伤载体转染的人视网膜母细胞瘤细胞的毒性检测
将电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤细胞，按相同的密度将细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为94.0%,91.6%,85.1%,80.0%,72.7%,69.9%和62.7%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P<0.05)，与未转染的细胞对应浓度组比较，当5FC浓度达到100mg/L后各对应浓度组间均存在差异(P<0.05)。当加入不同浓度的前体药物GCV培养5d后，平均细胞存活率分别为94.7%,90.3%,87.6%,82.9%,68.6%,57.6%和55.9%。SNK统计分析表明后3个数据与前4个数据有极显著性差异(P<0.05)，与未转染的细胞对应浓度组比较，当GCV浓度达到8μg/mL各对应浓度组间均存在差异(P<0.05)。加入不同浓度的双前体药物5FC+GCV培养5d后，平均细胞存活率分别为94.6%，89.2%，84.2%，81.0%，66.3%，56.4%和53.5%。统计分析表明各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P<0.05)。5FC,GCV与5FC+GCV组间采用SNK多重比较，当5FC达200mg/L,GCV达16 mg/L后，三组间平均细胞存活率均有统计学差异(P<0.05)，细胞存活率大小为：5FC>GCV>5FC+GCV。
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