张纯 李维义 黄萍 张绍敏 魏炜

　　100191北京大学第三医院眼科

　　宾夕法尼亚州立大学医学院

　　基金项目：国家自然科学基金(30772376)、国家自然科学基金(81041008)

　　目的：纯化培养、鉴定小鼠视网膜神经节细胞，并对其细胞的形态学、标记物、电生理特性进行研究，为视网膜神经节细胞的研究提供稳定可靠的研究系统，用于神经节细胞的保护等体外研究。

　　方法：改良纯化培养小鼠视网膜神经节细胞的方法，8-10只出生4-6天的C57小鼠的视网膜，37℃消化后得到单细胞悬液，两步法免疫平皿吸附去除MAC-1阳性细胞，获得Thy1.2阳性细胞，消化后培养于包被Poly-D-Lysine和Laminin的24孔板或96孔板。对获得的Thy1.2阳性细胞进行纯度、形态学、标记物鉴定，并行细胞电生理检测，建立NMDA损伤小鼠纯化培养的RGCs损伤模型。

　　结果：本纯化培养小鼠视网膜神经节细胞的改良方法，重复3次实验，得到视网膜组织中80%-90%的视网膜神经节细胞，细胞获得率高;纯化培养后第1天MAP2、Brn3a鉴定得到的纯化细胞中视网膜神经节细胞的纯度约95%，第3天约87%;纯化培养第1、3、7、10、14、21天存活的视网膜神经节细胞数量为纯化第0天的75%、50%、43%、40%、30%、20%;取纯化培养第3-5天的视网膜神经节细胞进行形态学、标记物鉴定、电生理检测，符合视网膜神经节细胞的特性。

　　讨论：在本课题组首次成功纯化培养小鼠视网膜神经节细胞方法的基础上进行改良，该方法稳定可靠，细胞获得率高，可以作为视网膜神经节细胞损伤的可靠技术。该方法应用到各种转基因模型小鼠的视网膜神经节细胞损伤的研究中，可以对视网膜神经节细胞损害的机制和视神经保护的研究提供技术方法支持。