作者：孙雪荣1,2，葛　坚1，章晓霜2，邓　飞1，胡惠玲1　 作者单位：(1.中山大学中山眼科中心、眼科学国家重点实验室，广东 广州　510000;2.湛江师范学院体育科学学院，广东 湛江　524000)

　　【摘要】 目的：Six3在视网膜发育中起着关键性的调节作用，然而商品化的Six3表达载体尚鲜见，本研究拟以pBaBb-puro为骨架，构建Six3真核表达载体。方法：以新生乳鼠眼cDNA为模板，通过PCR扩增出Six3编码序列，经酶切后，用T4 DNA连接酶将其与pBaBb-puro进行连接，经过转化、筛选后，进行酶切和测序鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得了含1002bp的Six3基因编码序列，经过酶切、连接、转化后，挑选12个菌落进行PCR检测，筛查到9个菌落含有重组质粒，对其中2个菌落进一步行酶切和测序鉴定，结果与理论预期完全相符。结论：成功构建了pBaBb-puro-Six3真核表达载体，为进一步研究Six3的功能奠定了基础。

　　【关键词】 Six3;视网膜;pBaBb-puro;表达载体;鼠

　　[ABSTRACT] Objective： To investigate the construction of eukaryotic expression vector of Six3 with pBaBb-puro as bone. Methods： cDNA of eyes in neonatal murine was selected as template， Six3 encoding sequence was amplified by PCR. After enzyme digestion， this sequence was linked with pBaBb-puro by T4 DNA ligase. After transformation and screening， enzyme digestion and sequencing were performed. Results： The100 2 bp encoding sequence of Six3 gene was obtained. Twelve colonies were selected for detection after enzyme digestion， linkage and transformation. It revealed 9 colonies with recombinant plasmid. And 2 colonies were selected for further enzyme digestion and sequencing. It showed the expected result. Conclusions： Eukaryotic expression vector pBaBb-puro-Six3 is successfully established. It provides foundation for further research on Six3.

　　[KEY WORDS] Six3; Retina; pBaBb-puro; Expression vector; Rat

　　视网膜神经细胞损伤后难以再生，临床上，许多患者最终因为视网膜神经细胞明显较少或缺如而导致不可逆性眼盲[1]。通过移植干细胞，替代损伤坏死的视网膜神经细胞，是治疗此类疾病的重要潜在手段。

　　在视网膜发育过程中，多潜能的视网膜祖细胞通过增殖、分化，先后产生视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells， RGCs)、视锥细胞、水平细胞、无长突细胞、视杆细胞，双极细胞及Muller细胞。此发育过程受某些关键基因，特别是转录因子的调节。

　　Six3是调节视网膜发育的关键基因，敲除后往往造成视网膜甚至眼球发育缺陷，而过表达则可引起某些特定细胞亚群的扩增[2-6]。最近研究还发现，过表达某些视网膜关键基因，可以重编程(Reprogramming)其他类型细胞为特定的视网膜神经细胞[7-9]。

　　体外过表达Six3，将可能有利于某些特定视网膜细胞的产生，从而有助于视网膜细胞替代治疗。然而，目前商品化的Six3表达载体鲜见，使得相关研究受到一定制约。本研究拟以pBABE-puro载体为骨架，通过分子克隆手段，构建含Six3基因的逆转录病毒表达载体，为后续研究Six3过表达在替代治疗中的作用奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　Rax基因的获取

　　依照我们以前报道的方法，在解剖显微镜下取出新生1～2 d乳鼠(C57 BL/6)的视网膜祖细胞[10]，并置于Trizol溶液(Gibco)中，按照说明书提取总RNA。经DNase Ⅰ(Sigma)处理后，用Fermentas公司的反转录试剂盒进行反转录，获得总cDNA。

　　用TaKaRa公司的PCR试剂盒，扩增Six3基因的编码序列，所用引物为：Six3-F： CGGAATTCATGGTATTCCGCTCCCCCCT，Six3-R：ACGC GTCGACTCATACATCACATTCCGAGTCGCT。30个循环后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。采用天根的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209-03)从电泳产物中回收目的片段。

　　1.2　酶切及连接反应

　　把Six3基因的胶回收产物和pBABE-puro载体分别用EcoR I(NEB)公司)和Sal I(NEB公司)进行双酶切反应，反应条件为：10×EcoR I buffer 6 μL， Sal I 2 μL， EcoR I 1 μL， Six3 20 μL或pBABE-puro 10 μL， 灭菌三蒸水 31或41 μL，总反应体积60 μL,37 ℃酶切2.5 h。

　　用T4 DNA连接酶(TaKaRa)分别将酶切后的Six3与pBABE-puro进行连接反应，16 ℃连接过夜。连接体系中PCR纯化产物和载体的摩尔比采用3∶1～8∶1的连接比例。

　　1.3　转化、筛选及鉴定

　　DH5α感受态大肠杆菌购自广州博川生物公司。转化操作简述如下：取5 μL连接产物加入到100 μL感受态细胞中，混匀后在冰上放置30 min。将管放入预加温到42 ℃的水浴中，热激60 s。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2 min。每管中加700 μL无抗生素LB培养基，37 ℃振荡培养45～60 min后，室温4 000 rpm离心5 min，弃去上清，用剩余100 μL培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB琼脂平板表面，倒置培养12～16 h后出现菌落。

　　挑取单菌落作为模板，进行菌落PCR检测，初步筛选到具有插入片段的克隆。菌落PCR引物序列为：pBABE_5_primer ctttatccagccctcac;pBABE_3_primer accctaactgacacacattcc。58 ℃退火，30个循环后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

　　选取菌落PCR鉴定出来的单克隆，培养扩增后，用普通质粒提取试剂盒(天根)提取质粒，用Sal I和EcoR I酶切后行电泳检测。将鉴定出的阳性克隆经上海英骏生物技术有限公司测序，以进一步证实质粒碱基序列的正确性。

　　2　结果

　　2.1　Six3基因的获取

　　新生乳鼠视网膜发育不成熟，含有较多的视网膜祖(前体)细胞，提取RNA并经RT-PCR反应后，可以获得较多含Six3编码序列的拷贝(图 1)。同时为了方便后面的载体构建，我们在PCR上下游引物末端分别加入了Sal I和EcoR I酶切序列。注：M：Marker D2000(从上到下条带大小分别为2 000，1 000,750,500 bp)。1、2道：Six3为约1 002 bp。图1　经RT-PCR扩增获得的Six3基因编码序列

　　2.2　菌落PCR鉴定

　　目的基因Six3经酶切、连接、转化等步骤后，在含有Amp的LB平板上形成大量的单克隆菌落。为了初步筛选到含有重组质粒的菌落，我们挑选12个菌落进行了PCR检测，其中有9个菌落含有重组质粒，结果如图2。注：M：Marker D2000(上到下条带大小分别为2 000,1 000,750,500 bp)。1～12道：Six3约为1 100 bp左右。图2　PCR鉴定菌落中的Six3

　　2.3　菌落酶切鉴定

　　初步筛选到含有目的基因的菌落后，我们扩增后进一步做了酶切鉴定，结果发现，EcoR I和Sal I双酶切后，电泳所获得的片段大小与理论计算相符(图 3)。注：M：Marker D2000(上到下条带大小分别为2 000,1 000，750,500 bp)。1：Six3为约1 002 bp。图3　菌落酶切电泳鉴定重组质粒

　　2.4　载体测序鉴定

　　将挑选出来的克隆进行扩增后，送公司测序以确定碱基序列的正确性。结果发现构建的Six3载体，其测序结果与Genebank参考序列一致，部分测序结果见图4。图4　重组质粒的测序鉴定

　　3　讨论

　　近年研究发现，高表达细胞发育的某些关键基因，可以将其他细胞重编程为该种细胞[7-9]。构建视网膜发育基因的表达载体，既有利于通过重编程获取视网膜种子细胞，同时也为研究该基因的功能提供了便利。

　　Six3属于同源盒转录因子，是Six/Sine同源盒家族的一员，在视网膜祖细胞中高表达，对视网膜的发育起着关键性调节作用。此外，在一些较成熟的无长突细胞和双级细胞中，也有Six3的表达[11]。

　　pBABE-puro逆转录病毒载体来源于莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus， MMLV)，是一种高拷贝的真核表达载体，具有转染效率高、外源基因表达稳定和无免疫原性等优点。

　　本研究利用pBABE-puro逆转录病毒构建Six3表达载体，将有利于对Six3基因功能的进一步研究。同时，通过在视网膜祖细胞中过表达Six3基因，将有可能获取大量的特异性视网膜神经细胞，如无长突细胞、双极细胞等，从而为视网膜神经性疾病的替代治疗提供种子细胞。

　　【参考文献】

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　　6　Carl M， Loosli F， Wittbrodt J. Six3 inactivation reveals its essential role for the formation and patterning of the vertebrate eye[J]. Development,2002,129：4057-4063.

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　　8　Ma W， Yan RT， Li X， et al. Reprogramming retinal pigment epithelium to differentiate toward retinal neurons with Sox2[J]. Stem Cells,2009,27：1376-1387.

　　9　Yan RT， Liang L， Ma W， et al. Neurogenin1 effectively reprograms cultured chick retinal pigment epithelial cells to differentiate toward photoreceptors[J]. J Comp Neurol,2010,518：526-546.

　　10　Sun X， Jiang R， Zhang Y， et al. Gene expression and differentiation characteristics in mice E13.5 and E17.5 neural retinal progenitors[J]. Mol Vis,2009,15：2503-2514.

　　11　田春雨，阴正勤. Muller细胞与视网膜神经元再生[J]. 军医进修学院学报，2006,27：475-476.