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眼部常见真菌的实验室诊断技术
http://www.cnophol.com 2008-1-4 14:59:47 中华眼科在线

　　
　　　　　　　　　　　　　　　　
　　
　　【真菌培养及鉴定】
　　　　（1）操作方法
　　　　①常用培养基：土豆葡萄糖培养基(首选)、沙氏培养基、察氏培养基。
　　　　②培养温度：25~28℃，湿度40%~50%。
　　　　③时间：3~10天。
　　　　④结果分析：根据真菌生长速度，菌落外观、菌丝、孢子或菌细胞形态特征等进行鉴别。
　　　　（2）鉴定方法
　　　　①湿片法：
　　　　采用乳酸酚棉蓝染液制成临时性的湿片标本，观察形态或测量其大小。
　　　　方法：
　　　　1)将洁净的载片中央滴一滴乳酸酚棉蓝染液。
　　　　2)用接种针从培养皿或试管的菌落上，挑取少许菌体，置载片的液滴中，并将菌丝体挑开，勿使成团。
　　　　3)加盖玻片即得到临时性湿片标本。
　　　　在观察时注意以下各项特征：
　　　　a 菌丝：气生菌丝和底部菌丝的宽度，有无横隔，色泽，特殊的菌丝器官（假根、足细胞、结节或隆起等），有无菌丝素，有无锁状联合等。
　　　　b 子实体的形态：成熟后子实体如孢子囊、子囊壳、子囊、担子果等等的颜色，形状，大小，结构等。
　　　　c 孢子：无性孢子如包囊孢子、分生孢子、芽孢子、节孢子、厚垣孢子等；有性孢子为卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担孢子等。它们的形状，颜色，表面的特征（如纹饰或突起等），孢子有无分隔（由单细胞还是多细胞构成），孢子萌发的类型（单极出芽、两极出芽或多极出芽等）。
　　　　附：乳酸酚棉蓝染液配置方法：结晶酚20g、乳酸20ml、甘油40ml、蒸馏水20ml，混合后隔水加热并充分搅拌直至完全溶解。然后加入棉蓝0.05g，混合均匀，必要时可过滤，瓶装备用。
　　　　②小培养法
　　　　1）方块法：
　　　　取无菌平皿倒入约15ml溶化的培养基，待凝固后以无菌小铲或接种刀划成1×1×0.5cm大小的小块,移在无菌载玻片上，然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株，盖上消毒的盖玻片。放入无菌平皿中的V形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，滤纸以无菌蒸馏水湿润，也可用无菌蒸馏水浸湿的棉球代替，置温箱培养。平皿必须保持湿润，需要时可加水。待菌落生长后，取出载玻片直接置显微镜下观察，也可待菌落充分生长后，揭下盖玻片，反面朝上，加95%酒精脱水，干后滴PVA乳酸酚棉蓝液封固，可长久保存。载玻片上的琼脂块移去后，若玻片上也有菌落生长，也可以同样的方法观察、制片保存。
　　　　2）钢圈法：
　　　　取直径约2cm、厚度约0.5cm有孔口的不锈钢小钢圈，将其在酒精灯火焰上烧热后蘸蜡趁热粘在无菌载玻片上，用灭菌滴管吸取或直接倒取事先溶化好的培养基，培养基量约占小钢圈容量的1/2，并形成一个小斜面，注意避免气泡。待培养基凝固后取一消毒盖玻片，火焰加热后，趁热盖在小钢圈表面。最后用接种针将待鉴定菌种通过通气孔接种在培养基的边缘（尽可能靠近盖片）。其余注意事项同小方块法。这种方法的优点是形成一种封闭式培养，不易被污染　　　　　　　　　　
　　【组织病理检查】
　　　　怀疑真菌性角膜炎而角膜刮片阴性者，可作角膜活检。用尖刀片切取角膜病损组织，或在穿透性角膜移植术时钻取病损组织，用10%甲醛或95%酒精固定，石蜡包埋，切片，染色（HE染色、PAS染色或吖叮橙染色等）。或用2.5%戊二醛固定，做电镜切片，观察真菌的超微结构。
　　　　引起眼部感染的常见放线菌主要有链霉菌、奴卡氏菌等，多引起角膜炎、泪小管炎、泪囊炎、结膜炎等。
　　　　（1）链霉菌（streptothrix）为纤细的分枝与不分枝的长菌丝，常断裂为杆菌与细小球菌，革兰氏染色着染不同，杆菌阴性，球菌阳性。 Giemsa 染色能更清楚地识别其形态。泪小管分泌物呈白、灰黄色凝块，压片染色镜检见菌块与菌体。培养生长较慢。常致下泪小管炎，并发慢性结膜炎、泪囊炎。
　　　　（2）奴卡氏菌（Nocardia）是一群需氧性放线菌，广泛分布于土壤中。多数为腐生的非致病菌，其中对人类有致病作用的有星形奴卡氏菌和巴西奴卡氏菌。本属为丝状，易断裂为杆菌与细小球菌。抗酸染色呈弱阳性反应，在普通培养基上菌落大小不等，表面有皱褶或呈颗粒状。不同种可产生不同色素，如黄色、橙红、红色以及其它颜色。眼部常引起角膜炎、泪囊炎、泪小管炎、结膜炎、眼内炎等。　　　　

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（来源：北京同仁眼科中心）（责编：xhhdm）
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