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眼部常见真菌的实验室诊断技术

http://www.cnophol.com 2008-1-4 14:59:47 中华眼科在线

  
                
  
  【真菌培养及鉴定】
    (1)操作方法
    ①常用培养基:土豆葡萄糖培养基(首选)、沙氏培养基、察氏培养基。
    ②培养温度:25~28℃,湿度40%~50%。
    ③时间:3~10天。
    ④结果分析:根据真菌生长速度,菌落外观、菌丝、孢子或菌细胞形态特征等进行鉴别。
    (2)鉴定方法
    ①湿片法:
    采用乳酸酚棉蓝染液制成临时性的湿片标本,观察形态或测量其大小。
    方法:
    1)将洁净的载片中央滴一滴乳酸酚棉蓝染液。
    2)用接种针从培养皿或试管的菌落上,挑取少许菌体,置载片的液滴中,并将菌丝体挑开,勿使成团。
    3)加盖玻片即得到临时性湿片标本。
    在观察时注意以下各项特征:
    a 菌丝:气生菌丝和底部菌丝的宽度,有无横隔,色泽,特殊的菌丝器官(假根、足细胞、结节或隆起等),有无菌丝素,有无锁状联合等。
    b 子实体的形态:成熟后子实体如孢子囊、子囊壳、子囊、担子果等等的颜色,形状,大小,结构等。
    c 孢子:无性孢子如包囊孢子、分生孢子、芽孢子、节孢子、厚垣孢子等;有性孢子为卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担孢子等。它们的形状,颜色,表面的特征(如纹饰或突起等),孢子有无分隔(由单细胞还是多细胞构成),孢子萌发的类型(单极出芽、两极出芽或多极出芽等)。
    附:乳酸酚棉蓝染液配置方法:结晶酚20g、乳酸20ml、甘油40ml、蒸馏水20ml,混合后隔水加热并充分搅拌直至完全溶解。然后加入棉蓝0.05g,混合均匀,必要时可过滤,瓶装备用。
    ②小培养法
    1)方块法:
    取无菌平皿倒入约15ml溶化的培养基,待凝固后以无菌小铲或接种刀划成1×1×0.5cm大小的小块,移在无菌载玻片上,然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株,盖上消毒的盖玻片。放入无菌平皿中的V形玻棒上,底部铺上无菌滤纸,滤纸以无菌蒸馏水湿润,也可用无菌蒸馏水浸湿的棉球代替,置温箱培养。平皿必须保持湿润,需要时可加水。待菌落生长后,取出载玻片直接置显微镜下观察,也可待菌落充分生长后,揭下盖玻片,反面朝上,加95%酒精脱水,干后滴PVA乳酸酚棉蓝液封固,可长久保存。载玻片上的琼脂块移去后,若玻片上也有菌落生长,也可以同样的方法观察、制片保存。
    2)钢圈法:
    取直径约2cm、厚度约0.5cm有孔口的不锈钢小钢圈,将其在酒精灯火焰上烧热后蘸蜡趁热粘在无菌载玻片上,用灭菌滴管吸取或直接倒取事先溶化好的培养基,培养基量约占小钢圈容量的1/2,并形成一个小斜面,注意避免气泡。待培养基凝固后取一消毒盖玻片,火焰加热后,趁热盖在小钢圈表面。最后用接种针将待鉴定菌种通过通气孔接种在培养基的边缘(尽可能靠近盖片)。其余注意事项同小方块法。这种方法的优点是形成一种封闭式培养,不易被污染          
  【组织病理检查】
    怀疑真菌性角膜炎而角膜刮片阴性者,可作角膜活检。用尖刀片切取角膜病损组织,或在穿透性角膜移植术时钻取病损组织,用10%甲醛或95%酒精固定,石蜡包埋,切片,染色(HE染色、PAS染色或吖叮橙染色等)。或用2.5%戊二醛固定,做电镜切片,观察真菌的超微结构。
    引起眼部感染的常见放线菌主要有链霉菌、奴卡氏菌等,多引起角膜炎、泪小管炎、泪囊炎、结膜炎等。
    (1)链霉菌(streptothrix)为纤细的分枝与不分枝的长菌丝,常断裂为杆菌与细小球菌,革兰氏染色着染不同,杆菌阴性,球菌阳性。 Giemsa 染色能更清楚地识别其形态。泪小管分泌物呈白、灰黄色凝块,压片染色镜检见菌块与菌体。培养生长较慢。常致下泪小管炎,并发慢性结膜炎、泪囊炎。
    (2)奴卡氏菌(Nocardia)是一群需氧性放线菌,广泛分布于土壤中。多数为腐生的非致病菌,其中对人类有致病作用的有星形奴卡氏菌和巴西奴卡氏菌。本属为丝状,易断裂为杆菌与细小球菌。抗酸染色呈弱阳性反应,在普通培养基上菌落大小不等,表面有皱褶或呈颗粒状。不同种可产生不同色素,如黄色、橙红、红色以及其它颜色。眼部常引起角膜炎、泪囊炎、泪小管炎、结膜炎、眼内炎等。    

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(来源:北京同仁眼科中心)(责编:xhhdm)

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