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眼部常见真菌的实验室诊断技术
http://www.cnophol.com 2008-1-4 14:59:47 中华眼科在线
　　　　
　　
　　
　　真菌的药物敏感实验
　　
　　　　1．纸片法：
　　
　　　　（1）培养基：沙氏葡萄糖琼脂培养基
　　　　（2）药敏纸片：新华1号滤纸，直径6mm，充分浸泡不同浓度和种类的药液，干燥。
　　　　（3）待测菌液的配制：
　　
　　　　①酵母菌：沙氏琼脂培养基上培养24~48小时后的菌落，用蒸馏水或生理盐水将菌落洗下，制成混悬液，浓度约为（0.5~2.5）×103CFU/ml，备用。
　　　　②丝状菌：培养7~10天生长旺盛的菌落，用蒸馏水或生理盐水将菌落洗下，以无菌玻璃珠研细，制成混悬液，浓度约为10×103CFU/ml，备用。
　　
　　　　（4）方法：将菌液均匀涂布于沙氏培养基上，贴药敏纸片，28℃培养。
　　　　（5）结果：48~72小时，观察抑菌圈的大小。
　　
　　　　2．酵母样真菌的微量稀释法
　　
　　　　根据美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）1992年提出的酵母菌液体培养基稀释法，抗真菌药敏试验参考方案(M27-P)及改良后的微量平板液体稀释法而设计。
　　
　　　　（1）材料：无菌96孔（u形）微量稀释板
　　　　（2）培养基：
　　
　　　　① RPMI 1640液体培养基
　　　　② YNB液体培养基
　　　　③ M3肉汤培养基
　　
　　　　（3）待测菌液的配制：沙氏琼脂培养基上培养24~48小时后的菌落，用蒸馏水或生理盐水将菌落洗下，制成混悬液，浓度约为（0.5~2.5）×103CFU/ml，备用。
　　　　（4）药液的配制：不同的药液浓度有所不同，根据抗真菌药物的具体情况选择浓度。采用倍比稀释法稀释药液，同时做药物稀释液对照，培养基对照，标准菌株对照。
　　　　（5）结果：按照酵母菌被完全抑制时的药物浓度定其MIC。
　　
　　　　3．NCCLS于1998年提出了《产孢丝状真菌的液体培养基稀释抗真菌药敏试验参考方案》（M38—P）。现将该方法简介如下：
　　
　　　　（1）被检测真菌　本方案主要用于眼科常见的镰刀霉、曲霉等产孢丝状真菌。
　　　　（2）抗真菌药物
　　
　　　　测试用药物包括眼科常用的氟康唑（FCZ），伊曲康唑（ICZ），那他霉素（NTC），特比耐芬（TBF）酮康唑（KCZ），二性霉素B（AMB）和5—氟胞嘧啶（5—FC）。其来源均为直接购自药厂的标准粉剂，禁用药房及其他临床制剂。
　　
　　　　（3）产孢丝状真菌的微量稀释法
　　
　　　　培养基　　建议用RPMI—1640液基，称取10.35gMOPS（三氮吗啡丙磺酸），3.12gRPMI—1640，加280ml蒸馏水溶解后用1M NaOH调整PH至7.0，定容至300ml，滤过灭菌，4℃备用。
　　
　　　　（4）实验过程与方法
　　　　 药物稀释液的制备：
　　　　 用RPMI—1640培养基将四种药物倍比稀释后依次加入96孔（12×8）板，每孔100μl，第一孔的浓度AMB、ICZ、TBF 为16μg/ml， NTC为64μg/ml。
　　
　　　　真菌接种液的制备：
　　　　受试菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上28℃培养3-5天，用无菌生理盐水制备菌悬液，用血球计数板调整菌悬液的浓度为（20~250）× 104/ml，然后加0.1ml至96孔药板的1~11列孔中，第11列为生长对照，第12列为阴性对照，28℃孵育46小时后读结果。
　　
　　　　结果判定：MIC值为肉眼直接观察到的真菌生长完全被抑制的抗真菌药物浓度。
　　
　　
　　引起眼部感染的常见真菌的种类
　　
　　　　引起眼部感染的常见真菌种类有镰刀菌属、曲霉属、青霉属、拟青霉属、链格霉属、枝孢霉属、短梗霉属、头孢霉属、无孢群、弯孢霉属、单端孢属、毛霉属、酵母菌等。

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（来源：北京同仁眼科中心）（责编：xhhdm）
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