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眼部常见真菌的实验室诊断技术

http://www.cnophol.com 2008-1-4 14:59:47 中华眼科在线
    
  
  
  真菌的药物敏感实验
  
    1.纸片法:
  
    (1)培养基:沙氏葡萄糖琼脂培养基
    (2)药敏纸片:新华1号滤纸,直径6mm,充分浸泡不同浓度和种类的药液,干燥。
    (3)待测菌液的配制:
  
    ①酵母菌:沙氏琼脂培养基上培养24~48小时后的菌落,用蒸馏水或生理盐水将菌落洗下,制成混悬液,浓度约为(0.5~2.5)×103CFU/ml,备用。
    ②丝状菌:培养7~10天生长旺盛的菌落,用蒸馏水或生理盐水将菌落洗下,以无菌玻璃珠研细,制成混悬液,浓度约为10×103CFU/ml,备用。
  
    (4)方法:将菌液均匀涂布于沙氏培养基上,贴药敏纸片,28℃培养。
    (5)结果:48~72小时,观察抑菌圈的大小。
  
    2.酵母样真菌的微量稀释法
  
    根据美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)1992年提出的酵母菌液体培养基稀释法,抗真菌药敏试验参考方案(M27-P)及改良后的微量平板液体稀释法而设计。
  
    (1)材料:无菌96孔(u形)微量稀释板
    (2)培养基:
  
    ① RPMI 1640液体培养基
    ② YNB液体培养基
    ③ M3肉汤培养基
  
    (3)待测菌液的配制:沙氏琼脂培养基上培养24~48小时后的菌落,用蒸馏水或生理盐水将菌落洗下,制成混悬液,浓度约为(0.5~2.5)×103CFU/ml,备用。
    (4)药液的配制:不同的药液浓度有所不同,根据抗真菌药物的具体情况选择浓度。采用倍比稀释法稀释药液,同时做药物稀释液对照,培养基对照,标准菌株对照。
    (5)结果:按照酵母菌被完全抑制时的药物浓度定其MIC。
  
    3.NCCLS于1998年提出了《产孢丝状真菌的液体培养基稀释抗真菌药敏试验参考方案》(M38—P)。现将该方法简介如下:
  
    (1)被检测真菌 本方案主要用于眼科常见的镰刀霉、曲霉等产孢丝状真菌。
    (2)抗真菌药物
  
    测试用药物包括眼科常用的氟康唑(FCZ),伊曲康唑(ICZ),那他霉素(NTC),特比耐芬(TBF)酮康唑(KCZ),二性霉素B(AMB)和5—氟胞嘧啶(5—FC)。其来源均为直接购自药厂的标准粉剂,禁用药房及其他临床制剂。
  
    (3)产孢丝状真菌的微量稀释法
  
    培养基  建议用RPMI—1640液基,称取10.35gMOPS(三氮吗啡丙磺酸),3.12gRPMI—1640,加280ml蒸馏水溶解后用1M NaOH调整PH至7.0,定容至300ml,滤过灭菌,4℃备用。
  
    (4)实验过程与方法
     药物稀释液的制备:
     用RPMI—1640培养基将四种药物倍比稀释后依次加入96孔(12×8)板,每孔100μl,第一孔的浓度AMB、ICZ、TBF 为16μg/ml, NTC为64μg/ml。
  
    真菌接种液的制备:
    受试菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上28℃培养3-5天,用无菌生理盐水制备菌悬液,用血球计数板调整菌悬液的浓度为(20~250)× 104/ml,然后加0.1ml至96孔药板的1~11列孔中,第11列为生长对照,第12列为阴性对照,28℃孵育46小时后读结果。
  
    结果判定:MIC值为肉眼直接观察到的真菌生长完全被抑制的抗真菌药物浓度。
  
  
  引起眼部感染的常见真菌的种类
  
    引起眼部感染的常见真菌种类有镰刀菌属、曲霉属、青霉属、拟青霉属、链格霉属、枝孢霉属、短梗霉属、头孢霉属、无孢群、弯孢霉属、单端孢属、毛霉属、酵母菌等。

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(来源:北京同仁眼科中心)(责编:xhhdm)

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