激光角膜光学切除术对角膜内皮细胞的影响
眼科新进展 1999年第2期第15卷 文献综述
作者：钟一声　王康孙
单位：200025　上海第二医科大学附属瑞金医院眼科中心
关键词：屈光性手术；角膜；内皮细胞

　　角膜内皮细胞是维持正常角膜功能的基本条件，这一连续单细胞层的物理屏障和代谢性泵功能平衡的维持在保持角膜透明性方面起着重要的作用。近年来发展起来的屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy,PRK)和激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis,LASIK)已成为屈光性角膜手术的研究热点。由于角膜内皮细胞特性及它所担负功能的重要性引起了人们对激光角膜光学切除术后角膜内皮细胞研究的关注。本文就激光角膜光学切除术对角膜内皮细胞的影响作一叙述。

　　1　激光角膜光学切除术后角膜内皮细胞的变化

　　1.1　细胞密度改变　激光角膜光学切除术后角膜内皮细胞密度变化报道不一，多数学者报道在-1.00～-13.5D近视眼中行PRK手术，术后追踪6～55mo未发现中央角膜内皮细胞密度改变［1～4］。Pallikaris等［5］对PRK矫治-8.80～-17.60D的10只眼进行追踪，发现术后6mo中央角膜内皮细胞密度降低5.69%，术后1a降低10.56%；Stulting等［6］对-1.60～-6.00D的142只眼施行PRK手术，于术前、术后3mo、1a和2a分别进行计算机辅助内皮细胞形态分析仪检查，发现术前中央和周边角膜内皮细胞密度分别为2660个·mm-1和2776个·mm-1，术后任何时间均未发现中央角膜内皮细胞密度明显改变，而周边角膜内皮细胞密度于术后3mo减少4.1%,术后1a减少6.2%,术后2a周边角膜内皮细胞密度又未见改变，他们推测术后周边角膜内皮细胞密度降低是由于周边部内皮细胞向中央部移行所致，而中央部角膜内皮细胞损伤由于及时得到补充而未能显示密度降低。Pallikaris等［7］对-8.00～-16.00D的39例患者施行LASIK手术，术后6mo发现内皮细胞缺失率为4.1%,术后12mo缺失率为8.67%，且矫治屈光度越高内皮细胞的缺失率亦越高。

　　1.2　细胞形态改变　准分子激光能导致角膜内皮细胞形态发生改变，激光切削深达150μm时，角膜内皮细胞可见F-肌动蛋白丝(F-actin filaments)缺失和细胞失去其六角形态［8,10,11］。Dehm等［9］报告激光切削兔角膜深达50％～90％角膜厚度时，角膜内皮细胞出现水肿和细胞连接紊乱。

　　1.3　超微结构改变　Lambert等［10］将人眼角膜施行激光切削深达150μm后进行角膜器官培养，1wk后发现切削区角膜内皮细胞发生组织病理学改变，出现细胞肿胀、线粒体撕裂、胞浆呈碎片状或空泡状，表明激光能导致角膜内皮细胞超微结构改变。

　　2　激光导致角膜内皮细胞损伤的机制

　　激光导致角膜内皮细胞损伤的确切机制尚不清楚，大多数学者认为与下列机制可能有关。
　　2.1　激光直接辐射　193nm ArF激光因其辐射穿透范围小于一个细胞直径，故其直接损伤角膜内皮细胞可能性不大［12,13］。但Berns等［14］报道使用激光能量315J·cm-1，切削深达80％角膜厚度时可见兔角膜内皮细胞发生急性损伤。

　　2.2　局部温度升高　PRK能导致角膜内皮细胞面温度升高3℃～4℃［16］，但局部组织温度升高必须达到11℃时，才能导致组织损伤［17］，因而温度升高造成内皮细胞损伤可能性不大；但Niizuma等［18］认为激光切除区温度升高不仅能导致角膜内皮细胞的损伤，而且与术后疼痛和上皮下混浊有关，因而建议PRK术前和术后用冷平衡盐溶液冷却角膜以减少角膜内皮细胞的损伤。

　　2.3　自由基损伤　PRK可导致房水成份发生改变，Costagliola等［19］发现在兔PRK后前房中过氧化氢、氧化型谷胱甘肽浓度增加，抗坏血酸浓度减少，因而认为房水中自由基产物能导致PRK后角膜内皮细胞损伤及白内障形成。

　　2.4　声学撞击波(acoustic shock waves)　Kent等［17］报道激光手术过程中产生可听见声音的声波通过角膜传播到内皮细胞层而造成内皮细胞的损伤；Stulting等［6］报告声学撞击波能导致角膜内皮细胞水肿、细胞连接紊乱和细胞内结构破坏。
 
　　2.5　前房炎症反应　Toda等［20］对1例PRK术后4d发生前房炎症反应的患者进行角膜内皮显微镜检查，发现角膜内皮细胞上有一暗斑(dark spots)，推测可能是炎症细胞或内皮细胞水肿所致，并且认为PRK术后炎症反应能导致角膜内皮细胞的缺失。
 
　　2.6　LASIK较PRK易损伤角膜内皮细胞的机制［17］　(1)LASIK是在130～160μm角膜瓣下施行角膜光学切除术，切削面与角膜内皮细胞距离较近；(2)LASIK多用于矫正高度近视，其切削较深，使用激光脉冲数较多；(3)LASIK角膜内皮细胞机械损伤不可能是吸环所致，而是由于声学撞击波和操作显微角膜刀所致。LASIK术中由于声学撞击波离角膜内皮层较近，因而易产生机械损伤。显微角膜刀致内皮细胞损伤报道不一，Aquavella等［21］报道使用显微角膜刀能致12.1%角膜内皮细胞缺失，而Binder等［22］报道使用显微角膜刀对角膜内皮细胞无影响。
　　3　激光对角膜内皮细胞影响的研究方法

　　3.1　在体研究

　　3.1.1　角膜内皮显微镜及计算机辅助的定量形态分析仪　目前已有接触型和非接触型角膜内皮显微镜在临床应用。接触型放大倍数大，分辨率较好，但检查需接触角膜；非接触型由于不直接接触角膜，利于患者接受及内眼手术早期使用，但放大倍数低，分辨率较差。计算机辅助角膜内皮显微镜能对角膜内皮细胞进行定量分析，包括细胞边界的长度和方向、细胞的边界数、细胞周长、六角形细胞百分率、细胞变异系数(细胞形态和细胞面积变异度)和细胞密度［3,6］。PRK或LASIK术前、后不同时间进行角膜内皮镜检查有利于评估内皮细胞的功能和观察内皮细胞的变化。

　　3.1.2　角膜荧光光度计　此法是检查角膜内皮细胞功能的方法，方法是：患者口服荧光素后，应用荧光光度计每30min分别测角膜和房水中荧光素浓度，共测6h，然后计算荧光素在角膜的转移系数，可定量评价角膜内皮细胞功能。PRK术前和术后进行角膜荧光光度计检查，可以观察到激光对角膜内皮细胞的影响［6］。

　　3.1.3　角膜厚度测量　角膜基质蛋白多糖具有将水吸入角膜的倾向，角膜内皮的Na+-K+泵主动转运离子而对抗水分进入角膜，以保持角膜透明和正常厚度。当角膜内皮细胞功能低下时，角膜水合作用增强，角膜厚度增加，因而角膜厚度测量可评价内皮细胞的功能。PRK后由于激光消融了一部分基质，使角膜厚度发生了改变，因此术后测量角膜厚度估计内皮细胞的功能意义不大，但术前角膜厚度测量有利于了解内皮细胞功能及估计激光对内皮细胞影响的可能性［17］。

　　3.2　离体研究

　　3.2.1　活性染料染色(vital dyes)　新近应用的活性染料Calcein-AM和Ethidium homodimer在研究角膜内皮细胞方面具有重要作用。该活性染料与以往应用的荧光素染料如吖啶橙等的主要不同之处在于它们对溶液中pH值不敏感，更易于细胞的活性分析［23～25］。Calcein-AM呈非荧光，易于渗入细胞膜，在活细胞内与胞浆脂酶反应产生一种非渗漏的荧光分子，在488nm兰光下见活细胞呈绿色荧光，而细胞外荧光很少，易于对活细胞进行观察；Ethidium homodimer是一种荧光染料，它不被有功能的活细胞所吸收，而易进入死细胞，与核中核酸相结合后其荧光效应放大40倍，在绿光下死细胞核呈红色。Kent等［17］将人尸眼角膜施行PRK或LASIK手术后进行角膜器官培养，1wk后用Calcein-AM和Ethidium homodimer进行内皮细胞染色，发现PRK术后死细胞率平均0.94个·mm-1,LASIK术后为3.08～5.55个·mm-1。该方法可以直观定量评价角膜内皮细胞的活、死细胞数。

　　3.2.2　若丹明偶联的鬼笔环肽　鬼笔环肽是一种蘑菇毒素，它能与细胞膜和F-肌动蛋白丝牢固结合，因而用于显示细胞表面形态和F-肌动蛋白丝的改变。Lambert等［10］将人眼进行PRK后行角膜器官培养，1wk后用若丹明偶联的鬼笔环肽进行染色显示PRK切削深达150μm时，角膜内皮细胞大小不一，且F-肌动蛋白丝消失。应用此法能较好地反映激光术后角膜内皮细胞骨架变化。

　　3.2.3　硝酸银染色法　硝酸银染色的机理尚不清楚，可能是细胞间富含氯或其他卤素物，使银还原成棕色产物所致，银染色能较好的估计出细胞膜的早期变化［26］。Lambert等［10］应用2.5g·L-1硝酸银染色显示PRK术后角膜内皮细胞大小不一，部分细胞间边界增宽。
　　3.2.4　透射电镜和扫描电镜　应用透射电镜(TEM)能显示细胞超微结构改变，如核质堆积、核膜的完整性、染色质改变、线粒体肿胀崩解、粗面内质网积聚膨大、胞浆空泡化等［10］；扫描电镜(SEM)能观察细胞的表面形态及细胞间连接情况等［9］。但轻微损伤时，TEM和SEM不易判别细胞死活，只有当细胞严重损伤时才能判别细胞死活。

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