2 结果

    2.1 人角膜缘干细胞对丝裂原激活同种异体外周血淋巴细胞的抑制作用 在ConA存在下，人外周血淋巴细胞发生显著的增殖效应。但将ConA加人外周血淋巴细胞在同种异体角膜缘干细胞及角膜上皮细胞培养的不同时间段的条件培养基中共育时，72h收集的不论是角膜缘干细胞或是角膜上皮细胞的条件培养基均对外周血淋巴细胞的增殖有显著性抑制作用(P<0.01)(见图1)。

    2.2 与人角膜缘干细胞共育对同种异体外周血淋巴细胞活性的影响 分别将角膜缘干细胞、角膜上皮细胞与等量的同种异体外周血淋巴细胞共育48h，角膜缘干细胞显著减弱同种异体人外周血淋巴细胞增殖反应(P<0.01)(见图2)。

    2.3 角膜上皮细胞对外周血淋巴细胞活性的影响 在角膜上皮细胞存在时，同种异体人外周血淋巴细胞活性未见明显受抑制，但角膜上皮细胞培养的72h上清对外周血淋巴细胞有显著抑制效应(见图1、2)。图1 淋巴细胞与角膜上皮细胞及角膜缘图2 角膜缘干细胞以及角膜上皮细胞与淋巴细胞混合培养

    2.4 角膜缘干细胞原代培养 与角膜上皮细胞原代培养相比，角膜缘干细胞增殖能力明显强于角膜上皮细胞，培养第3天，可见大量正在分裂的细胞(见图3)，培养第7天角膜缘干细胞增生分化出的上皮细胞已呈片状布满整个培养孔。图3 角膜缘干细胞原代培养

    3 讨论

    综合所述，可以得到以下推论：(1)角膜上皮细胞分泌的细胞因子有抑制同种异体外周血淋巴细胞的作用，但是将单层角膜上皮与外周血淋巴细胞共育以上作用就显著下降；(2)角膜缘干细胞可分泌抑制同种异体外周血淋巴细胞的细胞因子，并且在形成角膜缘干细胞单层后，这种对同种异体外周血淋巴细胞的抑制作用更强；(3)角膜缘干细胞或角膜上皮细胞体外培养，在72h产生相应的细胞因子对抑制外周血淋巴细胞增殖作用最显著。

    以上推论提示：角膜缘干细胞除了具有在角膜移植术后提供角膜上皮生长源泉从而降低排斥发生的作用外，还可能通过下述2条途径来实现其抑制免疫排斥反应的作用：(1)释放可溶性细胞因子；(2)通过细胞膜相关的抑制因子或细胞通讯。已证实在培养状态下角膜缘干细胞可表达IGF-1(insulin-like growth factor type 1)、TGF-β1、TGF-β2、LIF(leukemia inhibitory factor)、bFGF及其相关受体[6]。目前已研究发现在治疗由于干细胞缺乏所致的眼表疾病中，角膜缘干细胞移植术明显提高了单纯行部分穿透角膜移植的手术成功率。这一现象表明了干细胞对维持角膜处于相对免疫赦免状态起着重要作用[7，8]。但是目前尚未见对角膜缘干细胞免疫原性的研究报道，并已证实角膜缘干细胞具有屏障功能，可显著阻碍新生血管的长入[9]，但是角膜缘干细胞是否具有阻碍外周血淋巴细胞进入的功能尚未得到证实。

    我们的研究表明，角膜缘干细胞可能通过释放可溶性细胞因子以及细胞间通讯来有效地阻碍同种异体外周血淋巴细胞进入的功能。该作用尚未见其他研究报道证实。角膜缘干细胞移植是否通过阻碍同种异体外周血淋巴细胞进入而提高高危移植的成功率尚需进一步的实验及临床研究。

     【参考文献】

    1 洪荣照,吴护平,王印其,等.角膜缘移植联合穿透性角膜移植的临床观察.眼科,1998,7(4):224.

    2 龚向明,刘红山,钟兴武,等.角膜缘上皮移植联合角膜移植治疗眼化学烧伤.中国实用眼科杂志,1998,16(8):472.

    3 邓宏伟，李辰，陈建苏,等.角膜缘干细胞对外周血淋巴细胞活化和增殖作用的实验研究.眼科研究,2003，21(3)：261-263.

    4 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunological Methods,1983,65:55.

    5 Coligan JE,Kruisbeek AM,Margululies DH,et al.Current protocols in immunology.New York: Greene Publish in Gand Wiley Inter Science,1991,3-12.

    6 Li DQ,Tseng SCG.Three patterns of cytokine expression potentially involved in epithelial-fibroblast interactions of human ocular surface.J Cell Physiol,1995,163: 61.

    7 Holland EJ,Djalilian AR,Schwartz GS.Management of aniridic keratopathy with keratolimbal allograft: a limbal stem cell transplantation technique.Ophthalmology,2003,110(1):125-130.

    8 Solomon A,Ellies P,Anderson DF,et al.Long-term outcome of keratolimbal allograft with or without penetrating keratoplasty for total limbal stem cell deficiency.Ophthalmology,2002,109(6):1159-1166.

    9 Dua HS,Azuara-Blanco A.Limbal stem cells of the corneal epithelium.Surv of Ophthalmol,2000,44(5): 415.

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