【摘要】 目的 研究细胞凋亡信号分子Fas和细胞凋亡因子FasL在新鲜及深低温保存后角膜的表达情况、角膜细胞凋亡情况及其与角膜移植免疫排斥反应的关系。方法 (1)对35例角膜移植手术(25例新鲜角膜、10例冷冻保存)剩余组织应用免疫组织化学SABC法分别进行Fas和FasL蛋白染色。(2)应用Tunel法对上述标本进行细胞凋亡的研究。(3)观察35例部分穿透性角膜移植免疫排斥反应发生发展情况。结果 (1)角膜细胞Fas蛋白及FasL蛋白均为细胞质和(或)细胞膜着色。角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞Fas蛋白均呈阳性表达。角膜上皮细胞及内皮细胞FasL蛋白均呈阳性表达，而角膜基质细胞则无FasL蛋白表达。新鲜角膜和冷冻保存后角膜的Fas、FasL蛋白阳性表达量经统计学分析差异无显著性。(2)凋亡的角膜细胞均为细胞核着色。25例新鲜角膜平均每高倍视野可见凋亡细胞(1.788±0.621)个，经冷冻保存后的角膜(10例)每高倍视野可见凋亡细胞平均为(8.164±2.126)个，经统计学处理P<0.05，差异有显著性。(3)角膜移植免疫排斥反应发生与角膜的新鲜程度有关，新鲜角膜部分穿透性角膜移植术后6～12个月的免疫排斥反应发生率为12%(3/25)，深低温保存角膜移植后6～12个月的免疫排斥反应发生率为10%(1/10)，二者差异无显著性(P>0.05)。结论 (1)新鲜和深低温保存后的角膜均可见Fas、FasL蛋白的表达。其中Fas在角膜上皮、基质和内皮细胞均表达，FasL在角膜上皮、内皮细胞表达，而基质细胞不表达。(2)新鲜角膜可见极少量凋亡细胞，角膜经深低温冷冻保存后，凋亡细胞数量显著增加。降温-复温损伤可能与细胞凋亡有关。(3)角膜移植免疫排斥反应发生与角膜的新鲜程度有一定关系，深低温保存后角膜的抗原性可能降低，不易引起免疫排斥反应的发生。
【关键词】 Fas蛋白；FasL蛋白；凋亡；角膜移植免疫排斥
The study on correlation between apoptosis and cornea graft rejection
YANG Chao-zhong,ZHANG Jun,HUA Shan,et al.
Qingdao Dongfang Eye Institute,Qingdao 2660021,China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between expression of Fas/FasL and apoptotic cells in normal cornea and deep cryopreservative with cornea graft rejection in human.Methods SABC immunohistochemistry method was applied to study the expression of Fas/FasL in paraffin-embeded sections of 35 cornea.The tunel(TdT mediated biotin dUTP nick-end labeling,TUNEL) technique was used to study whether apoptosis would happy in both normal cornea and deep cryopreservative in human.Results In all positive cells,Fas/FasL were kytoplasm and cell membrane was stained.The positive expression of Fas protein was detected in 35/55 cornea,so was Fasl protein.Fas protein is expressed in corneal epithelial,keratocyte and endothelial cells.FasL ligand protein was detected in corneal epithelial and endothelial,neither was keratocyte cells.The number of apoptotic cells was significantly higher after cryopreservation(8.164±2.126) than noncryopreservation (1.788±0.621) (P<0.05).The rate of cornea graft rejection was 12%(nomal cornea) and 10%(cryopreservative cornea).Conclusion Fas protein and FasL ligand protein expressed in all cornea were not related to cryopreservation.The freeze-thaw trauma was maybe related to cryopreservation-induced cell apoptosis.It may reduce the rate of cornea graft rejection.
【Key words】 Fas protein;FasL protein;apoptosis;cornea graft rejection
角膜病是常见的致盲眼病，居致盲眼病的第二位。角膜移植手术是治疗角膜盲的重要手段。角膜材料的质量是影响角膜移植手术成功与否的主要因素。在保存过程中角膜细胞特别是角膜内皮细胞常受损，其可能的机制为死亡和细胞凋亡。Fas/FasL是与细胞凋亡密切相关的一对基因。FasL在角膜的广泛分布对维持角膜的免疫赦免地位和角膜移植的高成功率有重大意义。目前，角膜Fas/FasL及细胞凋亡与角膜移植免疫排斥反应关系的研究尚少。本文就细胞凋亡与角膜移植免疫排斥反应关系的初步研究结果报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象 35例(35眼)角膜移植患者系2000～2002年随即就诊,为单纯性角膜白斑,植片为7～7.75mm部分穿透性角膜移植,男23例(23眼)，女12例(12眼)；角膜为本院眼库提供，25例新鲜角膜，10例为深低温冷冻保存角膜。手术时将剩余角膜用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm切片。冷冻保存法采用简易二步法深低温保存[1]，冷冻时间1周～10个月，平均冷冻时间为(5.12±3.47)个月。
1.2 试剂及主要器械 Fas、FasL蛋白染色及Tunel法细胞凋亡试剂(武汉博士德公司分装的即用型试剂盒)；深低温保存角膜试剂有二甲基亚枫(DMSO)，20%人血白蛋白，液氮，QL-Ⅱ型生物降温仪。
1.3 实验方法
1.3.1 Fas、FasL蛋白免疫组织化学检测方法 采用即用型SABC法。阳性对照组：Fas、FasL试剂盒中自带阳性对照片作为阳性对照组；阴性对照组：用PBS代替一抗作为阴性对照组。
1.3.2 细胞凋亡检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的DNA缺口生物素-dUTP标记法[2](TdT mediated biotin dUTP nick-end labeling,TUNEL)原位标记。
1.4 实验结果判断
1.4.1 Fas、FasL判断 以细胞膜和(或)细胞质有清晰棕黄色颗粒着色为阳性染色细胞，细胞膜或细胞质无清晰棕黄色颗粒或无着色为阴性。
1.4.2 凋亡细胞判断 以细胞核呈棕黄色着色为阳性染色细胞，胞核无棕黄色着色为阴性细胞。每张切片随机取6个视野(高倍镜下)记数，取平均值为该片凋亡细胞数。
1.5 统计学方法 根据资料性质，分别采用完全随机设计资料的方差分析和t检验。P<0.05为差异有显著性。本实验所有统计均用SPSS统计软件包进行统计分析。
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