准分子激光对角膜内皮细胞影响的实验研究
眼科新进展 1999年第3期第19卷 研究原著
作者：钟一声 王康孙 廉井财 张蕾
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院眼科中心
关键词：激光角膜光学切除术；内皮细胞；兔
摘要 目的 观察激光角膜光学切除术(photorefractive keratectomy,PRK) 对角膜内皮细胞损伤的可能性。方法 采用有血清和无血清培养正常兔角膜和PRK切削深150μm角膜1wk后，观察内皮细胞形态和内皮细胞密度。结果 PRK切削深150μm无血清培养1wk后，角膜内皮细胞形态、大小不一 ，部分细胞边界染色较宽，内皮细胞密度明显低于对照组(P＜0.05)。PRK 切削深150μm有血清培养1wk后，角膜内皮细胞形态及大小与对照组基本一致，边界染色均匀，内皮细胞密度与对照组无明显差异(P＞0.05)。结论 PRK切削深150μm对角膜内皮细胞具有一定影响。血清中具有保护内皮细胞损伤的因子存在。临床上未能检测到内皮细胞缺失，可能是由于房水中存在保护内皮细胞损伤的因子。
［眼科新进展 1999；19(3)∶165-168］
Laboratory study of excimer laser effects on corneal endothelium
ZHONG Yi-Sheng,WANG Kang-Sun,LIAN Jing-Cai,ZHANG Lei
Abstract Objective To observe the possibility of endothelial cell damage after photorefractive keratectomy(PRK).Methods Endothelial cell morphology and densities of rabbit corneas after PRK ablation of 150μm depth were compared with those of the control group after cultured with or without serum for 1 week.Results Corneas cultured in serum-free medium after PRK ablation of 150μm depth showed endothelial cell variability in shap and size with the occasional thickening at the cell borders.The cell densities were less than those of the control group(P＜0.05). Corneas ablated to the same depth and cultured in serum-enriched medium had the endothelial cells in regular sizes and shapes,and no endothelial cell density loss compared with those of the control group (P＜0.05).Conclusions The PRK ablation of 150μm depth had some effects on endothelial cells and the effects may be prevented by factor(s) in serum. The disobviousness of cell loss in clinical studies may be due to the protective action of similar factors in aqueous humor.
Key words photorefractive keratectomy; endothelial cell; rabbit
［Rec Adv Ophthalmol 1999;19(3)∶165-168］
193nm准分子激光由于其切削组织精确、安全性好而成为目前屈光性角膜手术和治疗性光学角膜切削术的主要工具。屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy,PRK)对角膜上皮和角膜基质的影响以及它们与术后常见并发症的关系国内外研究较多［1，2］，对角膜内皮细胞的影响国外亦有研究，但结果报道不一［3］，而国内在这方面研究较少。由于准分子激光对角膜内皮细胞无即刻损伤作用，加之体内存在内皮细胞损伤修复机制，故我们采用体外培养角膜器官的方式来观察激光对角膜内皮细胞的影响，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 激光角膜切削术的模型建立
1.1.1 动物选择和分组 取新西兰健康大白兔16只，体重2.5～3.0kg，无眼疾患，雌雄兼用，随机分为2组，即未经激光切削的对照组6只兔(12眼)和激光切削角膜深150μm组10只兔(20眼)。根据加血清和不加血清角膜培养，每组再分为2个亚组，对照组每亚组6眼，激光切削组每亚组10眼。
1.1.2 PRK手术方式 将兔耳缘静脉麻醉后，10g·L-1Alcaine滴眼表面麻醉。按常规方法将兔双眼行PRK手术，所用激光参数设定为：-8.0D切削程序，深度为150μm，光学消融直径5.6mm。激光器为Chiron Vision 117-C型(USA)，每个脉冲能量密度为120mJ·cm-2，频率10Hz。
1.2 角膜器官培养
1.2.1 加血清培养液成份 采用DMEM和F12(1∶1)混合液，内含100mL·L-1胎牛血清(Gibco,USA)、青霉素100×103U·L-1、链霉素100mg·L-1、二性霉素B 3mg·L-1，pH值7.2～7.4。
1.2.2 无血清培养液成份 采用DMEM和F12(1∶1)混合液，内含转铁蛋白56.8μmol·L-1、胰岛素0.86mmol·L-1、硒30nmol·L-1、表皮生长因子0.01mg·L-1、氢化可的松20nmol·L-1、孕酮20nmol·L-1、丁二胺100μmol·L-1、10g·L-1葡聚糖40、0.5g·L-1牛血清白蛋白、维生素A 5U·L-1、青霉素100×103U·L-1、链霉素100mg·L-1、二性霉素B 3mg·L-1，pH值7.2～7.4。
1.2.3 角膜器官培养 动物麻醉后立即无菌下摘出眼球，生理盐水冲洗2～3次，入1∶1 000 Lugol碘液中浸泡1～2min后，生理盐水冲洗3次。超净台内沿距角膜缘约2～3mm处剪下角巩膜片，去除晶状体和玻璃体，轻轻撕去虹膜(勿触及角膜内皮)。角巩膜片放入含1g·L-1庆大霉素PBS中漂洗1次后，植入12孔培养板内(每孔植入一片)，内皮面朝上，分别缓慢加入含血清和不含血清培养液每孔3mL，置37℃、50mL·L-1CO2培养箱中培养，每48h换液1次。
1.3 角膜内皮细胞密度和形态观察
1.3.1 硝酸银染色 角巩膜片培养1wk后，PBS漂洗1次，按Smolin［4］方法进行硝酸银染色。染色后组织置25g·L-1戊二醛中4℃固定8h。
1.3.2 角膜内皮细胞观察和计数 将固定好的角巩膜片内皮面朝上置于载玻片上，用眼科剪沿1∶30、4∶30、7∶30、10∶30方位垂直角膜缘剪开角巩膜片周边后，内皮面上放置盖玻片，轻轻加压使角巩膜片铺平，胶布固定后，显微镜下观察内皮细胞的形态和边界。每一角膜片的切削区中央和周边5区(如图1)，分别计算20×物镜下内皮细胞数，将5区的内皮细胞数平均，即为每一角膜20×物镜下的平均内皮细胞数。
Figure 1 The five areas of the corneal endothelium under the ablation site that were assessed for cell density
行角膜内皮细胞计数的5区
2 结果
2.1 形态观察 硝酸银染色后，角膜内皮细胞边界染成黄色，胞浆和胞核不着色。正常对照组加血清和不加血清培养角膜内皮细胞形态似六角形态，相互嵌合，细胞大小形态一致，边界染色均一(见图2)；实验组内皮细胞形态亦类似六角形态，加血清培养组内皮细胞大小、形态与对照组基本一致，边界染色均一，不加血清培养组内皮细胞面积较对照组大，且部分细胞形态不规则，细胞边界染色稍宽(见图3)。
Figure 2 Flat mount of corneal endothelium cultured for 7 days in serum-free control group with silver nitrate to visualize cell borders.The cells appear regularly sized and uniformly hexagonal(20×)
对照组无血清培养角膜器官1wk后硝酸银染色显示内皮细胞边界。细胞呈大小一致的六角形态
Figure 3 Flat mount of corneal endothelium cultured for 7 days in serum-free treated group with silver nitrate to visualize cell borders.The cells show variability in cell shap and size with the occasional thickening at the cell borders(20×)
治疗组无血清培养角膜1wk后硝酸银染色显示内皮细胞边界。
细胞形态、大小不一，且部分细胞边界染色较宽
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