一、材料和方法

　　1.动物：选择国产大白兔，将其经耳缘静脉注气处死，立即在无菌条件下摘除眼球，置于0.6 u/L庆大霉素溶液中浸泡30 min，然后置于净化工作台上，将眼球移入无菌平皿中，于角巩缘内1 mm处取下全周角膜片，在Hank液中漂洗待用。

　　2.设备及器械: 解剖显微镜。无菌烧杯, 平皿, 2把眼科显微手术镊子,双面刀片及显微手术用刀柄或小止血钳。

　　3.方法:将角膜片内皮面向上置于无菌平皿中，在解剖显微镜下用刀片自角膜中心偏外处向边缘轻划一下，即可见附有角膜内皮细胞的Descemet膜出现一裂口，且边缘上卷，左手用镊子压住向上卷起的Descemet膜向下剥，或者右手换镊子夹住卷起的Descemet膜并将其撕下。一般数秒钟即可取下完整的带有内皮细胞的Descemet膜(图1,2)。可将带有内皮细胞的 descemet膜经胰蛋白酶消化，提取纯内皮细胞,种植于24孔组织培养板中,可见生长良好、单层无基质细胞及细菌污染的纯角膜内皮细胞（图3,4）。

　　二、结果

　　1.原代细胞培养：原代兔角膜内皮细胞种植24 h后可附着于培养板的底部，48 h后细胞向周围移行并增殖，2～3周内形成大片单层内皮细胞，当其贴壁后即成扁平多角形。新生的内皮细胞向周围移行增殖，细胞生长呈三角形至六角形不等，连接紧密，形成良好的单层。在角膜内皮细胞原代培养中，细胞分裂指数较低，约0.3%～0.4%,其指数增生期出现的时间与种植的细胞多少呈正相关，指数增生期出现的时间在接种后的4或5 d至2～3周,细胞达密集状态的时间约2～4周，如不进行传代培养，细胞生长即进入停止期，并在胞浆内开始出现粗大颗粒及空泡等衰老征象，逐渐出现细胞的死亡和脱落。

　　2.传代细胞培养方法： 原代培养的细胞置于0.25%胰蛋白酶溶液中消化5 min后，按1∶1、1∶2及1∶3接种传代，传代细胞12 h内即可见明显贴壁，约3～5 d可达密集状态，可继续传代，一般可传4或5代，传3、4代的内皮细胞有稳定的形态结构，成单层多角形，胞体较大，排列欠规则。一般一代细胞可倍增3～6次。

　　3.角膜内皮细胞培养：在24孔培养板中设置6个孔,每孔种植3～5个角膜内皮细胞，其增殖速度缓慢，指数增生期出现在2～3周之后,待成片生长后, 经1∶1反复传代4次, 于培养50 d后内皮细胞可达到密集状态。

　　4.混合细胞培养：实验中发现,角膜内皮细胞在纯培养中难以增殖或增殖速度缓慢,但如果角膜内皮细胞中有基质细胞污染，则角膜内皮细胞的增殖速度可明显加快。

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