1　视网膜变性疾病基因治疗特点

　　视网膜变性疾病的基因治疗为难以进行的中枢神经系统变性疾病的治疗提供了良好的窗口并起到桥梁作用。眼组织基因治疗具有①容易施行；②视网膜在活体内可借助检眼镜直接观察；③由于有血房水屏障，血视网膜屏障有利于载体在眼内达到一定的有效浓度，同时使眼处于相对免疫赦免状态等优点。然而，视网膜神经细胞的基因治疗与其它神经细胞一样都面临着同样的难题有待解决，即目的基因高度有效地转染和表达的调控。因为视网膜变性疾病引起视力丧失的最终原因是感光细胞的凋亡，由于感光细胞是有丝分裂后细胞，基因的转染率及其目的基因在眼内的表达比有丝分裂细胞(如视网膜色素上皮细胞)要困难得多。如何选择有效的载体系统，减少排斥反应，延长目的基因的表达就显得更为重要。

　　2　载体的选择与评估

　　为了使目的基因在体内长期表达必须使目的基因进入细胞核并与宿主染色体整合或在染色体外稳定地复制，选择有效的载体是解决这一问题的关键。理想的载体系统要求［1］：①高浓度(病毒颗粒数＞108 /ml)可使许多细胞转染；②产物可扩增；③能整合到宿主染色体特定部位或能在染色体外稳定地复制；④调节因子能对翻译产物进行调节；⑤能特异性地转染所需的细胞类型；⑥不含免疫反应的成分。

　　目前，眼内基因治疗所用的载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体有逆转录病毒载体，腺病毒载体，单纯疱疹病毒载体等；非转录病毒载体主要有阳离子脂质体。

　　病毒载体：①逆转录病毒载体［2］(retroviral vector)：以RNA为模板复制DNA，其基因组包括gag、pol、env并带有一个长末端重复(long terminal repeat,LTRs)序列使之易于宿主染色体整合，同时还有加强启动作用，控制病毒基因的表达，该载体主要用于有丝分裂细胞的转染，视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)是分裂很慢的细胞，感光细胞是有丝分裂后细胞，因而它的应用受到限制。目前该载体主要用于将凋亡基因转入玻璃体腔，防止增生性玻璃体视网膜病变的复发［3］。将来也可用于脉络膜视网膜新生血管疾病的治疗。②慢病毒载体(lentiviral vector)［1，4-6］：属于逆转录病毒家族，其中应用最广的是免疫缺陷病毒HIV，包括gag,pol,env三个基因，它还带有六个辅助蛋白基因(tat、rve、vpr、vpu、ref和vif)，治疗基因位于LTRs和包装序列(packaging)之间。其最大插入的碱基对为7．0～7.5　kb。它的优点是能转染有丝分裂和非有丝分裂细胞，是目前表达时间最长的载体。慢病毒载体主入鼠的眼、脑、肝脏及肌肉内，能使报告基因表达6个月。③单纯疱疹病毒(Ⅰ型)(herpes simplex virus typeⅠ)载体［7，8］：其浓度可达1010　pfu/ml，它可转染几乎所有的细胞类型，对神经原细胞包括感光细胞有很好的亲和性，而且可逃避宿主的免疫反应。因为在潜伏期大部分病毒基因的表达已关闭，不过目的基因本身也被关闭，所以，体内基因转染后仅表达几天。研究发现该病毒具有一定的神经毒性。④腺病毒(adenovirus)载体［9］：是小的dsDNA病毒，不能与宿主DNA整合，在宿主染色体外复制。可插入碱基对数多达30　kb，尤其适合大基因片段如bcl-2基因的转染。该病毒可产生很高的滴度(病毒颗数1011 /ml)。整合腺病毒(recombination　adenovinus，rAV）在眼内转基因研究应用最广［2，10-12］，可转染眼内许多细胞类型包括感光细胞。玻璃体腔内注射视神经节细胞可被转染；视网膜下腔注射后RPE可高度转染。其缺点是可引起宿主的免疫反应。腺病毒基因编码的病毒蛋白前房内注射可随房水循环进入静脉，视网膜下腔注射可导致血视网膜屏障的破坏，所以对腺病毒而言，前房和视网膜并非是免疫赦免区。⑤腺病毒相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体［4-15］：该病毒不仅能转染有丝分裂细胞，还能转染非分裂的神经原细胞。野生型AAV能特异的整合到人体第19号染色体上。由于它去除了所有病毒编码的蛋白质，减少了免疫反应，对人体无任何毒性。该病毒体积小，能穿过视网膜各层组织，缺点是很难纯化达到高浓度(病毒颗粒数约1012／ml)，而且插入的最大基因片段较小，仅4.7　kb。同一个报告基因，用rAAV(recombination,rAAV)载体在感光细胞的转染率是rAAV载体的2　000倍［16］。尽管如此，对感光细胞而言其转染率仍然不超过1%［8，17，18］。研究表明：在RD(retinal degeneration,RD)鼠视网膜下腔及玻璃体腔内注射rAV6周后，报告基因在感光细胞的转染率为1%；RPE细胞的转染率为90%；视网膜神经节细胞的转染率为5%［17］。由于体积小，它能穿过视网膜各层，视网膜下腔注射后，报告基因在节细胞和双极细胞中能表达。玻璃体腔注射后RPE细胞也能表达。

　　非病毒载体：主要为阳离子脂质体。与病毒载体相比，阳离子脂质体的转染效率较高，仅需1/104个质粒分子通过阳离子脂质体提呈给靶细胞就能到达细胞核并表达，而病毒载体则需10个病毒分子与靶细胞结合，并仅有一个被转染并表达［19］。它可包裹目的基因及载体穿过细胞膜，进入细胞浆、细胞核，虽然不能与宿主染色体整合，但可表达缺失的蛋白质，起替代治疗的作用。由于脂质体转染的目的基因在体内表达时间短，须重复给药。就目前研究水平而言，对于光感受器—类有丝分裂后细胞，要实现基因替换治疗尚有一段距离，但应用基因替代治疗缓解视网膜变性性疾病仍不失为目前研究的方向之一。

　　3　视网膜组织基因治疗的途径及部位

　　基因治疗的途径主要分为体内(in vivo)基因注射和修饰细胞回体(ex　vivo)移植两种方法。体内转基因的方法主要是利用病毒或非病毒载体将目的基因转入靶细胞内。回体移植途径是指将来源于体内的细胞经基因修饰后植入患者体内使基因在体内表达作为缺失蛋白的来源。这种方法广泛用于中枢神经系统变性疾病的基因治疗［20，21］。

　　视网膜组织基因治疗的体内途径部位主要有玻璃体腔内注射和视网膜下腔注射。其中玻璃体腔内注射操作相对容易、安全，但玻璃体积血、视网膜脱离、眼内炎等并发症不能忽略。视网膜下腔注射除可转染感光细胞外，同时能转染RPE细胞，但易造成局限性视网膜脱离而引起感光细胞凋亡，这要求操作者有一定视网膜手术的经验与技术。目前认为，视网膜下腔注射是最有效的接近感光细胞的方法，另外，RPE细胞的基因转染率较高，色素上皮转染后分泌目的基因的产物可被感光细胞利用。其它部位还包括脉络膜、巩膜基因植入和巩膜上腔基因注射，用基因枪将DNA颗粒注入视网膜内，或静脉内注射转基因成分也可使RPE转染等。

　　4　感光细胞的营救

　　感光细胞的凋亡是视网膜变性疾病引起视力丧失的根本原因，为了恢复视功能，感光细胞移植、RPE移植及各种神经营养因子的辅助治疗应运而生。在基因治疗方面，可以通过抑制凋亡的共同通路防止感光细胞变性，也可针对感光细胞特异性基因突变进行转基因治疗。业已证明，抗凋亡基因如bcl-2能延缓感光细胞的凋亡，转感光细胞特异性基因βPDE（phosphodiesterase,PDE)也能延缓感光细胞凋亡［22］。

　　Bennett等［23］在新生5天RD鼠视网膜下腔注入βPDE基因(用rAV为载体)，3周后，视网膜显示3～4层结构，对照组仅有一层，正常鼠为8～9层。到第7周时，治疗组与对照组无差别。说明βPDE基因能延缓感光细胞凋亡。感光细胞的营救一方面是感光细胞本身被转染，另一方面可能是RPE细胞转染后通过分泌βPDE的基因产物被感光细胞摄取利用。Lem［22］研究发现，用感光细胞特异性启动子：视紫质蛋白基因上游片段2.5　kb　HRP(human rhodopsin protein,HRP)可非常有效的启动感光细胞特异性转基因的表达，这样可避免对邻近细胞的毒性。Bennett等［10］进一步证实该启动子的作用，同时对bcl-2与βPDE的感光细胞营救作了比较，以rAV载体用2.5　kb　HRP启动bcl-2　cDNA转入新生5天的RD鼠视网膜下腔后17天感光细胞核及突触连接处有bcl-2的表达；视网膜下腔注射Ad．CMVPDE(以腺病毒为载体CMV启动的PDEcDNA)和Ad2．5HRP　bcl-2均能延缓感光细胞凋亡，但bcl-2不及PDE作用明显。单独用Ad．CMV．PDE的作用与Ad．CMV．PDE+Ad2．5　HRP　bcl-2联合注射的效果一致。

　　感光细胞的营救还可通过提高眼内神经营养因子的水平延缓感光细胞变性。用这种方法感光细胞本身不一定要被转染，可通过邻近细胞的转染如RPE转染后分泌营养因子被感光细胞利用。研究表明，以rAV为载体，睫状神经营养因子玻璃体腔内注射后，能延缓RD鼠感光细胞变性［24］。

　　为了解决感光细胞转基因的长期表达，应尽量选择对有丝分裂后细胞转染有效的载体，如rAAV载体、慢病毒载体及AV载体。为了减少AV载体对宿主的免疫反应和延长目的基因的表达，新一代的AV载体剪去了病毒DNA的E1和E2区，有学者用免疫调节分子局部联合注射，抑制局部的免疫反应，如CTLA4-Ig(免疫球蛋白Cr-2a与T细胞表面受体CTA4即CD152融合形成)。研究表明，视网膜下腔联合注射rAV编码的分泌性免疫调节分子CTLA4　-Ig，可延长β苷乳糖报告基因在视网膜细胞的表达［11］。为了减少炎症反应，改善视网膜的功能，有学者联合玻璃体切割及SF6填充后，玻璃体腔内注射rAV，当rAV携带的lacZ报告基因与视网膜充分接触30分钟后，用PBS液冲洗未转染的病毒，可减少炎症反应对视网膜功能的损害［12］。

　　5　神经前体细胞的应用前景

　　在眼部，有学者将患者体内的细胞如成纤维细胞取出后经基因工程加工修饰后再植入视网膜，使转基因表达的产物作为一些缺失蛋白的来源，同时，表达的基因产物还可在细胞内通过进一步修饰以利于靶细胞如感光细胞摄取利用。这种方法对于体内转基因不能长期表达的感光细胞来说是很有前景的方法。

　　近年来，永生化神经前体细胞转基因移植在中枢神经系统变性疾病的治疗方面显示了很好的应用前景。永生化神经前体细胞或神经干细胞的特点是：①体外培养时不分化，能自我更新。②能够单个分离并克隆；③可在体外进行基因加工或修饰，移植到体内能使报告基因长期稳定地表达；④在体内具有多功能干细胞的特点［25］。研究表明：①移植到脑内特定部位的微环境中，能定向分化为该区特异性的神经原同时能整合到该区的神经组织中［26］；②前体干细胞在局部微环境中的增生能力很强，在病理情况下这些前体细胞在分化时可被修饰，并且不会形成肿瘤［27］；③用神经前体细胞体内转基因表达，可通过药物进行调节干预［27］。

　　通过近几年来的努力，已能在发育或成年的中枢神经系统中分离并扩增具有多潜能的神经原干细胞或前体细胞，目前，已建立了多种永生化神经前体细胞的细胞株：如HiB5，RN33B，RN46A，ST14A，C17-2细胞株等［25，27］，这些技术为应用干细胞样特性的细胞株作为中枢神经系统移植，基因转染提供了新的细胞来源。同时，作为基因转染的前体细胞移植到中枢神经系统后，能分泌营养因子或产生代谢酶，从而使变性的神经组织再生，这些为神经变性疾病提供了很有前途的治疗方法。眼作为神经系统的一个特殊成员，神经前体细胞的应用也应有一定前景，即使在眼内不能定向分化作为变性细胞的组织来源，也有可能从其转基因稳定表达的特性，为视网膜组织转基因治疗带来一线曙光。