摘要　目的　探讨视网膜Müller细胞在眼免疫赦免诱导和维持中的作用。方法　在Wistar大鼠和新西兰白兔的右眼玻璃体腔接种Müller细胞的特异性破坏剂L-α-氨基已二酸(L-α-AAA)和10g·L-1牛血清白蛋白。不同时间分别摘除接种眼，进行透射电镜检查。动物模型建立1wk后，进行DTH的诱导和测量。结果　玻璃体腔接种L-α-AAA 4h，视网膜Müller细胞肿胀、电子密度降低；12h以上病变加重；48h以上病变减轻；72h恢复正常。玻璃体腔接种L-α-AAA和抗原组的动物DTH反应均呈阴性。非玻璃体腔抗原接种组动物均呈阳性反应。结论　在短时间内、单一的破坏视网膜Müller细胞，并不能造成眼免疫赦免状态的削弱或破坏。眼免疫赦免是一多因素、多机制的免疫调节过程，各因素之间具有相互叠加和相互补偿的作用。

Effect of retinal Mller cells injury on ocular immune privilege

　　PENG Guang-Hua,LI Zhi-Jie,LI Chen

　　Abstract　Objective 　To examine the effect of retinal Müller cell injury on the inducement and maintenance of ocular immune privilege.Methods　L-α-aminoadipic acid (L-α-AAA),specific gliotoxic agent with bovine serum albumin (BSA)was injected into the vitreous cavity of the right eyes of Wistar rats and New Zealand white rabbits.The eyeballs during different time intervals after vitreous cavity injection were inspected by emission electron microscopy.One week after receiving an immunogenic regimen of BSA in adjuvant,the ability of inducing vitreous cavity associated immune deviation (VCAID)was evaluated.Results　All the animals receiving intraocular L-α-AAA inoculation did not display DTH reaction. There was no significant difference between the in oculated and contralateral sites (PBS).The swelling and loss of electron density of Müller cell cytoplasm were significantly noted and retina recovered to normal morphology in 4 hours and 72 hours after introcular injection of L-α-AAA respectively.Conclusions　These data suggest that the in vivo injury of Müllor cells may not interfere with the inducement and maintenance of ocular immue privilege.

　　Key words　immune privilege;immune deviation; retina;Müller cell

　　视网膜Müller细胞在维持正常的视网膜功能中起着重要的作用。业已证明，葡萄膜视网膜炎及外伤性增殖性玻璃体视网膜病变等眼病的发生和发展与视网膜Müller细胞存在着密切的关系［1，2］。然而，视网膜Müller细胞在维持眼免疫赦免中的作用尚不清楚。本实验旨在体内特异性破坏视网膜Müller细胞的功能，以探讨视网膜Müller细胞在诱导和维持眼免疫赦免中的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂制备　L-α-AAA,Sigma)溶解在磷酸盐缓冲液phosph-ate buffer saline,PBS,pH7.2)中，浓度为20g·L-1；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶解在PBS中，浓度为10g·L-1，分别用微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌，分装后-20℃保存，供玻璃体腔注射用。

　　1.2　实验动物　选择健康无眼疾的Wistar大鼠(Ⅱ级，雄性，体重100±10g，60只)和新西兰白兔(纯系，雄性，体重2.0±0.2kg，45只)，由中山医科大学动物实验中心提供。

　　1.3　实验分组　每种动物均随机分为3组：(1)常规免疫组；(2)玻璃体相关免疫偏离组；(3)破坏视网膜Müller细胞组。

　　1.4　动物模型的建立

　　1.4.1　玻璃体相关免疫偏离动物模型的建立　氯胺酮(25mg·kg-1)和氯丙嗪(25mg·kg-1)混合肌肉注射诱导全身麻醉，5g·L-1地卡因眼表面麻醉，手术显微镜下利用微量注射系统(接种针头0.3mm×8mm,Singapore)，在右眼颞上象限角膜缘内1mm处前房穿刺，抽取少量房水(大鼠10μL、新西兰白兔100μL)，降低眼压以避免注射抗原溢出。然后，在颞上象限平坦部向玻璃体腔内接种抗原(5g·L-1BSA)，接种抗原量分别为：大鼠10μL、新西兰白兔100μL。术后结膜囊内涂抗生素眼膏，裂隙灯显微镜下观察眼部情况。

　　1.4.2　破坏视网膜Müller细胞动物模型的建立　按玻璃体相关免疫偏离动物模型的方法，利用微量注射系统在实验动物的右眼玻璃体腔内接种，其接种量：大鼠10μL、白兔100μL(L-α-AAA和10g·L-1BSA各半)。

　　1.5　DTH的诱导方法　以上2组动物眼内接种抗原1wk后，与常规免疫组相同，用0.5g·L-1BSA与CFA的混合乳剂(比例1∶1)免疫动物，大鼠每只前足掌皮下注射50μL；新西兰白兔臀部皮下每点注射100μL，共2点。动物免疫1wk后，进行再次抗原注射，大鼠右足皮内注射5g·L-1BSA 100μL，左足皮内注射PBS 100μL作为阴性对照；新西兰白兔背部右侧皮内注射2点，每点5g·L-1BSA 100μL，左侧皮内注射相同体积的PBS作为阴性对照。

　　1.6　DTH的测量方法　动物再次免疫24h，用工程游标卡尺(精确度为0.01mm)测量大鼠的足肿厚度；用毫米尺测量新西兰白兔的皮肤红斑的垂直径，红班直径＞4mm为阳性反应。测量结果采用两样本均数比较的t检验。

　　1.7　透射电镜检查　玻璃体腔注射后4h、12h、24h、48h、72h分别摘除眼球，从赤道部注入25g·L-1戊二醛(大鼠注入10μL、白兔注入100μL)，20min后放在25g·L-1戊二醛的蜡盘中，用剃须刀取视神经下方的眼球壁，大小约1mm×1mm×3mm，置入25g·L-1戊二醛的标本瓶中，4℃固定12h，充分冲洗后再进行10g·L-1锇酸后固定(4℃)1.5～2h。常规使用乙醇、丙酮脱水，包埋剂浸泡组织2h后，再置入塑料模具中加入包埋剂进行聚合、修块、制备半薄切片定位后，超薄切片，醋酸双氧铀-硝酸铅双重染色，透射电镜［JEOL(JEM)100CXII/T］下进行观察并摄像记录。

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