摘　要：目的　观察雷公藤多甙防治抗原诱导性葡萄膜视网膜炎(antigen-induced uveoretinitis,AIU)的临床效果，并探讨免疫学机制。方法　使用牛S抗原和福氏完全佐剂的混合乳剂免疫大鼠14d后，将S抗原接种于玻璃体腔，建立AIU动物模型。实施雷公藤多甙治疗方案，观察其对实验动物的眼部临床表现、病理组织学、血清抗体效价、淋巴细胞增殖反应以及抗原特异性迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity,DTH)的影响。结果　对照组炎症持续时间平均为12.90d，雷公藤治疗组为7.63d(P＜0.01)，对照组抗体滴度平均为1∶8～1∶16，雷公藤治疗组为1∶4，受ConA和S抗原刺激的淋巴细胞增殖反应对照组平均为0.68OD和0.84OD，雷公藤治疗组为0.49OD(P＜0.01)和0.67OD(P＜0.01)，对照组DTH平均为1.75mm，雷公藤治疗组为0.66mm(P＜0.01)。结论　雷公藤可下调AIU的细胞免疫和体液免疫，具有潜在的应用价值。

CHEN Jian-Su,LI Chen

　　(Department of Ophthalmology)

　　LI Zhi-Jie

　　(Institute of Tissue Transplantation and Immunology,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

　　Abstract：Objective　To observe the clinical effect of tripterygium wilfordii hook f(TⅡ)in treating antigen-induced uveoretinitis(AIU)and investigate the immunologic mechanism.Methods　Rats were immunized with S antigen emulsified in complete Friend's adjuvant.Fourteen days later,S antigen was injected into the vitreous cavity.In this way,AIU models were induced in rats.AIU rats were fed with TⅡ.Clinical and histopathologic evaluation of treated eyes,serum antibody titers,lymphocyte proliferation assay and DTH testing were carried out in order to observe the influence.Results　The duration of inflammation averaged 12.90 days in the control group,7.63 days in AIU rats fed with TⅡ(P＜0.01).Serum antibody titers were 1∶8～1∶16 in the control group,1∶4 in AIU rats fed with TⅡ.The lymphocyte proliferation stimulated by ConA and S antigen were respectively 0.68 OD and 0.84 OD in the control group,0.49OD and 0.67OD in AIU rats fed with TⅡ(P＜0.01).DTH averaged 1.75mm in the control group,0.66mm in AIU rats fed with TⅡ(P＜0.01).Conclusion　TⅡ can significantly suppress cellular and humoral immunity of AIU,with potential value of application.

　　Key words：tripterygium wilfordii hook f;antigen-induced uveoretinitis;uvcitis▲

　　雷公藤为卫矛科植物，具有免疫抑制、抗炎、抗肿瘤和抗菌作用。至今已从雷公藤中分离出70多种化学成分，雷公藤多甙(tripterygium wilfor-dii hook f,TⅡ)是其主要的抗炎成分，既保留了雷公藤生药的免疫抑制作用，又去除了许多毒性成分。文献报道雷公藤对类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、紫殿和牛皮鲜等自身免疫性疾病有较好的疗效^［1］。TⅡ可防治人工晶状体植入术后的眼内炎症反应^［2］以及角膜移植免疫排斥反应^［3，4］。本实验利用抗原诱导性葡萄膜视网膜炎(antigen-induced uveoretinitis,AIU)动物模型观察了TⅡ对抗原诱导性葡萄膜视网膜炎的影响，并对其作用机理进行了探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物、模型及分组

　　1.1.1　实验动物　重量为140～180g的Wistar大鼠，雌雄不限。

　　1.1.2　AIU动物模型　参照我们以前的方法，提取和纯化牛视网膜S抗原^［5］。将牛视网膜S抗原(1g·L^-1)加等量福氏完全佐剂充分混合成乳剂，取0.2mL(含S抗原100μg)分别皮下注射于Wistar大鼠的后足底部致敏大鼠。14d后，前房穿刺后用微量进样器在睫状体平坦部刺入玻璃体腔内注入含10μg牛S抗原的PBS溶液10μL。

　　1.1.3　分组　实验组：S抗原免疫口服TⅡS抗原玻璃体腔注射口服TⅡ程序。用于观察TⅡ对AIU的影响。对照组：S抗原免疫口服牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(7次，隔日1次，每次1mg)S抗原玻璃体腔注射口服BSA(7次，隔日1次，每次1mg)程序。

　　1.2　TⅡ治疗方案　用上述方法以S抗原致敏15只大鼠，7d后开始口服TⅡ(上海医科大学红旗制药厂)，口服TⅡ前用生理盐水将其制成悬液，30mg·kg^-1.d^-1，每日2次给药，连续用药7d。再用上述方法将S抗原注入玻璃体腔。术后继续口服TⅡ直至处死动物取材进行组织学或免疫学检查。

　　1.3　临床观察　大鼠玻璃体腔注射后从术后观察至术后第20天，托品酰胺扩瞳后用裂隙灯显微镜、手术显微镜和检眼镜双盲法检查大鼠双眼并记录临床改变。以睫状血管、房水、虹膜血管、瞳孔大小、晶状体、玻璃体和眼底的改变为标准，根据修改的Wacker等^［6］制定的标准(需要者可向作者索取)判断AIU的严重程度，并进行综合临床分级。

　　1.4　组织学观察　常规视网膜组织学切片及苏木素-伊红染色。

　　1.5　免疫学观察

　　1.5.1　血清抗体滴度测定　双向免疫扩散法检查血清抗S抗原抗体效价，5g·L^-1氨基黑染色，1mol·L^-1醋酸脱色。

　　1.5.2　淋巴细胞增殖反应测定　按照Mosmann^［7］的MTT比色分析法测定免疫鼠脾淋巴细胞增殖反应。

　　1.5.3　迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity,DTH)的诱导和测定　在AIU动物模型建立1wk后，右前足底注射S抗原100μL(1g·L^-1)，左前足底注射生理盐水100μL作为阴性对照，24h后用游标卡尺测量双前足底厚度。

　　2　结果

　　2.1　临床观察　雷公藤口服组及对照组的临床分级和炎症持续时间见表1～2。

表1　雷公藤多甙治疗AIU第1、3、5天临床分级

　　Table 1　Clinical evaluation of AIU treated

　　with TⅡ on the first,third and fifth day

*The first day after S antigen was injected into vitreous cavity,compared with control group　　玻璃体腔S抗原注射术后第1天　^aP＜0.05，^bP＜0.05，与对照组比较^aP＞0.05，^bP＜0.05

表2　雷公藤多甙治疗AIU临床表现持续时间

　　Table 2　Clinical duration of AIU treated with TⅡ

	n	(d)
TⅡfed	8	7.63±1.19a
BSA fed(control)	7	12.90±4.14

Compared with control group，^aP＜0.01，与对照组比较^aP＜0.01

　　2.2　组织学观察　对照组有全葡萄膜炎的病理改变，主要表现有前房和玻璃体腔大量炎性细胞渗出，虹膜、睫状体和脉络膜视网膜增厚并有炎性细胞浸润。雷公藤口服组前房和玻璃体腔炎性细胞渗出较少，葡萄膜和视网膜炎性细胞轻度浸润。

　　2.3　血清抗体滴度测定　5只实验组大鼠血清抗体滴度平均为1∶4，5只对照组大鼠平均为1∶8～1∶16，实验组与对照组比较，S抗原和稀释血清之间的反应带稍弱(图1)。

　　Figure 1　Shows immunodiffusion plate reaction of serum in AIU rats(periphery)with S antigen of bovine(center).Serum antibody titers of control were 1∶16(left),and serum antibody titers of TⅡfed were 1∶4(right)　AIU大鼠血清(外围孔)和牛S抗原(中央孔)双向免疫扩散的反应带，左侧为对照组，抗血清滴度1∶16，右侧为实验组，抗血清滴度1∶4

　　2.4　淋巴细胞增殖反应测定　倒置显微镜下观察培养细胞的生长情况，发现雷公藤口服组与对照组比较，加入S抗原刺激剂后发生增殖的淋巴细胞数较少，形成克隆的细胞簇也较少。MTT测定的OD值均有下降(与对照组比较P＜0.01)，见表3。

表3　MTT比色分析法测定淋巴细胞转化^*

　　Table 3　Lymphocyte proliferation assay assessed by MTT

　　colorimetric determination(OD)(1×10⁶ spleen cells/well)

Compared with control group,^aP＜0.01，与对照组比较^aP＜0.01

[1] [2] 下一页