眼科研究 2000年第1期第18卷 实验研究
作者：高建华 张东杲 宫枢政
单位：高建华 宫枢政（昆明，成都军区昆明总医院眼科 650032）；张东杲（第四军医大学唐都医院眼科）
关键词：一氧化氮合成酶；一氧化氮；NADPH黄递酶；视觉系统；组织化学；幼猫
摘要 目的 观察一氧化氮 合成酶在正常幼猫视觉系统的分布，探讨一氧化氮在视觉系统中的作用。方法 用NADPH 黄递酶(NDP)组织化学染色法观察了一氧化氮合成酶在正常幼猫视觉系统视网膜、外侧膝状 体、视皮层的分布。结果 正常幼猫视网膜和视皮层17区均可见NOS阳性细胞和纤维；外 侧膝状体(LGN)各层无NOS阳性细胞，但可见NOS阳性纤维。结论 一氧化氮可能作为一种重要的神经递质参与视觉信息的形成、整合和传递。
分类号 R774.01
Distributio n of nitric oxide synthase in visual sys tem of normal kittens
Gao Jianhua Zhang Donggao Gong Shuzheng
（Department of Oph thalmology，Kunming General Hospital，
Kun m ing 650032）
Abstract Objective To observ e the distribution of nitric oxide synth ase （NOS） in the visual system of normal kittens and to discuss the role of nitric oxide （NO） in the visual system．Meth ods The distributions of NOS in the ret in a，lateral geniculate nucleus （LGN） and s triate cortex of normal kittens were stu died by using the NADPH-diaphorase （NDP） histochemical method．Results In norma l kittens，NOS positive cells and fibers occurred in retina and striate cortex but NOS positive cells were not seen in any lamina of LGN where NOS positive fibers were discovered．Conclusion NOS might be acting as a new class of neurotransmitte r and may be involved in the formation，regulation and transmission of visual inf ormation．
Key words nitric oxide synthas enitric oxide visual system NADPH-diaph orase histochemistrykitten
一氧化氮(nitric oxide，NO）是一种化学性质活泼且不稳定的气体，近年来新发现它具有神经递质样作用。早期研究表明NO可影响视觉发育、参与视觉形成、整合和传递，推测NO可影响弱视的发生［1～3］。一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS）为其合成的关键酶，通过检测NOS可以间接反映NO的水平［4］。NOS和NADPH-diaphorase在神经系统内共存且完全相同，用硝基四唑氮兰(nitroblue tetrazolium，NBT)显示NADPH-diaphorase法即可显示NOS［5］。本实验用NADPH黄递酶组织化学染色法观察了一氧化氮合成酶在正常幼猫视网膜、外侧膝状体、视皮层的分布。
1 材料和方法
1．1 动物准备：2～4周龄健康家猫6只，用1%阿托品滴眼液和5%新福林滴眼液散瞳，收缩瞬膜，检查屈光间质及眼底有无异常，检影验光。在正常同等视条件下散养至14～16周龄。所有幼猫经氯氨酮(15mg／kg)肌注麻醉，VETs-Ⅲ视觉电生理检查系统记录PVEP波幅，右眼(10.54±1.3)μV，左眼(10.61±1.01)μV；潜伏期右眼(57.50±4.34)ms，左眼(58.92±4.29)ms，并再次用1%阿托品滴眼液和5%新福林滴眼液散瞳，收缩瞬膜，检影验光。所有幼猫屈光间质及眼底均未见异常。
1．2 实验过程
1．2．1 组织化学染色
6只幼猫分别在腹腔内注射戊巴比妥钠(30mg／kg)深度麻醉，开胸、主动脉插管，右心房放血，快速灌注生理盐水400ml，再灌注4%多聚甲醛0.1mol／L磷酸缓冲液(PB，4℃)1200ml，先快后慢，持续120min。开颅取脑，完整摘除眼球。在活体显微镜下用游标卡尺测量眼球前后径、左右径和水平径。用剃须刀片沿眼球赤道部切开眼球，剥离视网膜并将其分为4片。脑及视网膜放入4%多聚甲醛0.1mol／L磷酸缓冲液(4℃)中固定2h，然后，置于20%蔗糖0.1mol／L磷酸缓冲液(4℃)中至脑沉底。按Snider的猫脑立体定位图，分离双侧视皮层17区和外侧膝状体(lateral geniculate nucleus，LGN)作冠状连续冰冻切片，片厚50μm，一部分直接贴片，余切片放入网格中，0.01mol／L钾-磷酸缓冲液(KPBS)漂洗2次。按部位分别放入美国产24孔细胞培养板，加反应液(NBT2.5mg溶于100μl的二甲基亚砜中；β-NADPH-diaphorase(Sigma公司产品)10mg溶于10ml0.3%triton-X-100 0.01mol／LKPBS；上述两液混合即为反应液)30μl，轻振荡，置于37℃恒温箱内孵育60～90min，用0.01mol／LPBS漂洗2次，中止反应。裱片，部分切片行中性红复染。每组各取1片行Niss染色，视网膜行平铺片。梯次脱水、透明、封片。
1．2．2 切片及视网膜平铺片均采用Olympus-2HD显微镜观察，部分结果细胞计数、照相。照片经计算机图像分析系统测量：视网膜细胞密度、视皮层的NOS阳性细胞密度及平均面积。
2 结果
2．1 视网膜：正常幼猫视网膜平铺片可见NOS阳性细胞，形状不规则，无长树突，中-重度染色，边界模糊，以视网膜中央区较多，并可见细小的NOS阳性纤维，以血管处为明显，主要为无长突细胞。视网膜NOS阳性细胞数(±s)／mm2，OD：57.2±6.4，OS：57.9±5.2，左右眼差异无显著性(P＞0.05)。
2．2 外侧膝状体：正常组幼猫LGN各层均未见NOS阳性细胞，但可见致密的NOS阳性轴突和末梢，以A层为最密，C层稀疏。
2．3 视皮层：正常幼猫视皮层17区各层均可见NOS阳性细胞，但Ⅰ层最少，Ⅱ、Ⅲ层最多，Ⅳ、Ⅴ层其次。细胞中度染色，胞浆浓染，胞核淡染，无突起，呈圆形或椭圆形，Ⅳ层偶见具有较长树突和轴突的细胞。白质NOS阳性细胞较多，均匀浓染，胞核稍淡，可见细长树突和轴突。皮质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各层均可见染色均匀的NOS阳性纤维。
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