眼科研究 2000年第1期第18卷 实验研究

作者：钟一声　周颍明　王康孙

单位：上海第二医科大学附属瑞金医院眼科中心 200025

关键词：异搏定；转移生长因子-β₁；角膜基质细胞

　　摘要　目的 探讨异搏定(Verapamil)对体外培养兔角膜基质细胞分泌TGF-β₁的影响。为预防或减轻PRK后混浊(haze)形成提供线索。方法 将传代培养细胞，在加药培养后48h，应用TGF-β₁　E_max^TM　ImmunoAssay　System试剂盒对培养上清中TGF-β₁含量进行检测，根据标准曲线分别计算出各孔TGF-β₁的浓度。结果Verapamil浓度5μg／ml和10μg／ml，作用48h，培养上清中TGF-β₁含量明显降低(P＜0．05)。Verapamil浓度越高，培养上清中TGF-β₁含量越少。结论 Verapamil能明显抑制角膜基质细胞分泌TGF-β₁，可望成为预防或减轻PRK后haze形成的药物。

　　分类号　R772

The effect of verapamil on the production of transforming growth factor-β₁ in

　　keratocytes in vitro

Zhong Yisheng　Zhou Yingming　Wang Kangsun

　　（Ophthalmic Center，Ruijin Hospital，Shanghai Second Medical

　　University，Shanghai 200025）

　　Abstract ObjectiveTo investigate the effect of verapamil on keratocytes in vitro for the production of transforming growth factor（TGF-β₁)，and make progress in pharmacological prevention or reduction of haze formation after PRK．Methods Cultured keratocytes were exposed to a different concentration of verapamil solution．TGF-β₁ production from supernatant was investigated by TGF-β₁ ImmunoAssay System after 48 h of verapamil exposure．The TGF-β₁ concentrations in supernatant were calculated by the TGF-β₁ standard curve．Results Verapamil （5μg／ml and 10μg／ml） can inhibit TGF-β₁ secretion of rabbit keratocytes after incubation for 48h（P＜0．05)．The inhibition effect of 10μg／ml verapamil was higher than those of 5μg／ml verapamil．Conclusion Verapamil can inhibit TGF-β₁ production from rabbit keratocytes，and might become a new drug for prevention of reduction of haze formation after PRK．

　　Key words　verapamil transforming growth factor-β₁ keratocytes

　　准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive　keratectomy，PRK)后角膜上皮下混浊(haze)形成与术后伤口愈合过程中角膜基质细胞增生活跃有关，因此，寻求抑制术后角膜基质细胞过度增生且副作用小的药物是一值得研究的课题。最近研究表明钙离子通道阻滞剂异搏定(Verapamil)具有明显抑制成纤维细胞增殖的作用^［1］，具有很好的应用前景但其抑制细胞增殖的确切机制尚未明了。本文旨在观察Verapamil对培养角膜基质细胞分泌转移生长因子β₁

　　(transforming growth factor-β₁，TGF-β₁)的影响，以期探讨其抑制角膜伤口愈合的部分机制。

　　1材料和方法

　　1．1　材料

　　1．1．1　实验动物：3只体重约2．5～3kg新西兰白兔(雌雄不限)(中国预防医学科学院寄生虫病研究所提供)，静脉麻醉后检查无眼疾。

　　1．1．2　培养液：采用DMEM培养液，内含10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，10mmol／L Hepes，100U／ml青霉素，100μg／ml链霉素，2.5μg／ml二性霉素B，pH＝7.2～7.4。

　　1．1．3　试剂和仪器：Verapamil为上海禾丰制药有限公司产品，规格为5mg／2ml。TGF-β₁　E_max^TMImmunoAssay System(Cat．No．G1230)试剂盒为Promega公司产品。仪器：Bio-RAD Model 450型酶标仪。

　　1．1．4　药物终浓度：Verapamil 2.5、5、10μg／ml。

　　1．2　方法

　　1．2．1　细胞培养和药物加入

　　参照我们报告的方法进行兔角膜基质细胞培养^［2］，取2～3代角膜基质细胞，0.1%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸(ethylenediaminotetraacetic acid，EDTA)消化后，用DMEM培养液调整细胞浓度为2×10⁴／ml，接种于24孔培养板中，每孔1ml，于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h后，去除培养液，每孔加入新鲜培养液1ml，同时加100μl含不同药物浓度的培养液，使其终浓度达预定值，对照组加不含药物的培养液，每一处理因素做4个平行孔，继续CO₂培养箱中培养。

　　1．2．2　培养上清TGF-β₁的检测

　　加入药物培养48h后，小心吸出培养上清，离心去除细胞残渣后，取上清进行TGF-β₁的定量测量。TGF-β₁的检测按照TGF-β₁ E_max^TM ImmunoAssay System试剂盒说明进行，同时绘制TGF-β₁标准曲线，终止反应后，用酶标仪测450nm吸光值。根据标准曲线，采用586计算机Microsoft Excel中Forecast函数分别计算出各孔TGF-β₁的含量，并进行统计学处理和作图。

　　1．2．3　细胞数量检测

　　细胞培养过程中，每日用倒置显微镜观察各孔细胞增殖情况。药物作用48h去除培养上清后，采用0.1%胰蛋白酶及0.01%EDTA消化后，2%台盼兰染色行活细胞计数，以确定各孔存活细胞数量是否一致。

　　2结果

　　2．1　细胞生长情况

　　各培养时期，加药物孔和未加药物孔细胞生长增殖情况相似；药物作用48 h后，各孔细胞已达基本融合状态。2%台盼兰染色检查各孔活细胞数量相似。

　　2．2　Verapamil对培养角膜基质细胞分泌TGF-β₁的含量

　　Verapamil浓度为2.5μg／ml，作用48h，培养上清中TGF-β₁含量较对照组降低，但经统计学处理，无明显差异(P＜0．05)；浓度为5μg／ml和10μg／ml时，培养上清中TGF-β₁含量明显低于对照组，经统计学处理，均有显著性差异(P＜0．05)，且Verapamil浓度越高，培养上清中TGF-β₁含量越少(见图1)。

图1　Verapamil作用48h后培养上清中TGF-β₁含量

　　Fig．1　The concentration of TGF-β₁ in supernatant after verapamil exposure for 48h

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