中华眼科杂志 2000年第1期第36卷 眼表疾病
作者：赵敏 陈家祺 杨培增
单位：赵敏（重庆医科大学第一医院眼科 400016）；陈家祺（中山医科大学中山眼科中心）；杨培增（中山医科大学中山眼科中心）
关键词：角膜；烧伤；化学；模型；免疫学；免疫组织化学；平片技术
【摘要】 目的 探讨角膜碱烧伤后眼局部的免疫反应机制。 方法 在大鼠角膜上制作碱烧伤模型。在烧伤后的不同阶段，制备角膜、虹膜组织平片，采用标准的卵白素-生物素过氧化物酶复合物免疫组化(avidin-biotin complex ，ABC)方法，观察眼局部T淋巴细胞亚群、巨噬细胞、树突细胞、主要组织相容性复合物（major histocompability complex，MHC）-Ⅱ类抗原阳性细胞的动态变化。结果 碱烧伤后早期，角膜及虹膜即有T淋巴细胞浸润，以CD＋3淋巴细胞为主，MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞也轻度增多。在角膜溶解穿孔阶段，T淋巴细胞浸润达到高峰，其中CD＋4淋巴细胞明显多于CD＋8淋巴细胞；巨噬细胞、树突细胞、MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞大量出现。上述细胞密集分布于角膜缘，其中淋巴细胞及MHC-Ⅱ类抗原阳性细胞可见于角膜溶解处及中央区。在烧伤后期角膜溃疡已进入修复阶段，虹膜上依然可见多量各类阳性细胞。结论 免疫反应可能参与了角膜重度碱烧伤后的组织病变过程，在角膜溶解穿孔及眼内炎症的发生中起重要作用。
Immunologic experimental studies on the alkali burn of cornea in rats
ZHAO Min
（Department of Ophthalmology, First Teaching Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016，China）
CHEN Jiaqi, YANG Peizeng.
【Abstract】 Objective To investigate the immune reaction of severe corneal alkali burns. Methods The models of severe corneal alkali burns were induced in rats. Immunohistochemistry was carried out on wholemounts of the cornea and iris at different time points after corneal burns to detect T-lymphocytes and their subpopulation, macrophages, dentritic cells and MHC class Ⅱ-positive cells. Results In the early stage of the burns, there were small increasing number of T-lymphocytes and MHC class Ⅱ-positive cells in the cornea and iris. At the period of corneal melting and perforation, a massive influx of lymphocytes (CD＋3, CD＋4, CD＋8), macrophages and dentritic cells was seen in the cornea adjacent to the limbus and iris. CD＋4 lymphocytes were much more than CD＋8 in number. T-cells and MHC class Ⅱ-positive cells were observed not only at the limbus but also in the melting area and corneal center. Morphological changes of these cells were also noted. In the restoration stage, a number of positive cells were still found in the iris. Conclusion Immunological mechanism is involved in the pathological changes of the damage induced by corneal alkali burns, especially in the pathogenesis of the corneal melting and perforation.
【Key words】 Cornea； Burn, chemical； Models，immunology； Immunohistochemistry； Wholemount
角膜重度碱烧伤后常发生顽固性溃疡，甚至溶解穿孔，在这个病理过程中，免疫学机制是否参与，一直是人们关注的问题；对碱烧伤后是否应用皮质激素治疗也一直存在着争论。为了探讨眼碱烧伤后的免疫反应，我们采用眼组织平片技术，对碱烧伤后的角膜及虹膜组织进行免疫组织化学研究，观察眼局部T淋巴细胞亚群、巨噬细胞、树突细胞、主要组织相容性复合物（major histocompability complex，MHC）-Ⅱ类抗原阳性细胞的动态变化。
材料和方法
一、材料
健康SD(sprague dawley)大鼠20只，体重150～200 g，鼠龄6～8周，雌雄各半。
二、方法
采用0.2 ml氨胺酮+0.1 ml氯丙嗪腹腔注射麻醉，将直径5 mm 的圆形滤纸在1 mol/L NaOH中充分浸透，取出滤纸，吸除滤液，贴于角膜中央烧灼30 s；移去滤纸后，立即用生理盐水冲洗结膜囊，以0.5%新霉素眼液滴眼。
1.取组织标本时间：在3个不同时间段取病变组织标本：(1)烧伤早期(2或3 d)；(2)角膜溶解即将穿孔或穿孔初期(7～12 d，平均8.5 d)；(3)溃疡愈合，新生血管生长，病情稳定时的恢复期(均在14 d以上，平均20 d)。
2.标本制作步骤：采用杨培增等［1，2］所用方法制作眼组织平片。麻醉后，于大鼠左心室内注射106U/L肝素0.3 ml以抗凝血，从左心室插管至主动脉，用250 ml预冷的磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)灌注，充分排除血管床中的血液成分；摘除眼球，在手术显微镜下从睫状体平坦部切开眼球，分离出虹膜、角膜组织，各取4片，移入100%冷乙醇中固定5～10 min，再移入0.01 mol/L PBS液中，4℃贮存备用。免疫组织化学染色采用卵白素-生物素过氧化物酶复合物(avidin-biotin complex, ABC)法。一抗采用小鼠抗大鼠IgG(购自Holland biotechnology公司)，包括抗CD＋ 3、CD＋ 4、CD＋ 8淋巴细胞，树突细胞，巨噬细胞，MHC-II类抗原抗体；二抗采用生物素标记的羊抗小鼠IgG(华美生物制品公司)。眼组织平片ABC法染色主要步骤在24孔培养板中进行；将染色好的组织片平铺于凝胶包被的载玻片上，常规封片；阴性对照以PBS液代替一抗。光镜下观察。
[1] [2] 下一页 |
