中华眼科杂志 1999年第1期第35卷 眼表疾病
作者：高晓唯 楼月芳 奚寿增 冯伟华
单位：楼月芳 奚寿增（200003 上海第二军医大学长征医院眼科）；高晓唯（研究生，现在中国人民解放军第四七四医院眼科中心，830011）；冯伟华（上海第二军医大学分子生物学教研室）
关键词：软骨；抑制；角膜新生血管化
【摘要】 目的 观察软骨源抑制因子(cartilage-derived inhibitor, CDI)在活体状态下对角膜新生血管的抑制效果。方法 制备高纯度的CDI和4组(64只眼)的兔角膜新生血管模型,采用角膜微袋分析技术和病理方法定量检测，观察在不同情况下CDI对角膜新生血管的抑制作用。结果 纯化的CDI对角膜新生血管的生长速度和生长面积均有显著的抑制作用(P＜0.001)。结论 纯化的CDI在一定条件下能特异性地抑制机体组织中的角膜新生血管生长,抑制效果呈剂量依赖性。
An experimental study of anti-angiogenesis with a cartilage-derived inhibitor
GAO Xiaowei*, LOU Yuefang, XI Shouzeng, et al.
*Department of Ophthalmology, Changzheng Hospital,
Second Military Medical University, Shanghai 200003
【Abstract】 Objective To evaluate the efficacy of a cartilage-derived inhibitor for the treatment of corneal neovascularization in vivo.Methods A cartilage-derived inhibitor (CDI) from bovine scapula was purified to homogeneity. By rabbit corneal neovascularization(CNV) model, the effect of inhibition of CDI under various conditions was determined in corneal micropocket analysis.Results The purified CDI could inhibit strongly the growing speed and area of rabbit CNV compared to control (P＜0.001).Conclusion It is demonstrated that CDI is a potent dose-dependent inhibitor of angiogenesis.
【Key words】 Cartilage Inhibition Corneal neovascularization
软骨源抑制因子(cartilage-derived inhibitor,CDI)是一种相对分子质量为27 000的水溶性蛋白质,广泛存在于脊椎动物和人的软骨组织中,在维持正常软骨无血管状态中起着重要的作用。自1990年Moses等首次提纯了牛软骨中的CDI以来,许多实验研究表明CDI有强烈抑制毛细血管内皮细胞(endothelial cell,EC)增殖和移行的活性［1］。为观察CDI在机体组织中是否也能抑制角膜新生血管的增殖及其效果,我们制备了高纯度的CDI,采用兔角膜微袋分析技术［2］,对CDI抑制角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的情况进行了定量检测,现报告如下。
材料和方法
一、CDI的制备和鉴定
将新鲜的牛肩胛软骨在无菌和4℃条件下粉碎,2 mol/L氯化钠浸提,除去组织碎屑后在4℃离心(15 000 r/min)1小时,取上清液,用25%和60%硫酸铵分次沉淀。将沉淀物溶于配制的三羟甲烷缓冲液中,透析除去盐分。然后进行:(1)Bio-Gel A 1.5 m柱分离层析;(2)CM-Sephadex C 50柱离子交换层析;(3)Sephadex G-75(超细)柱纯化层析。收集CDI,透析浓缩。用考马斯亮蓝法测定蛋白含量,分装冷冻干燥后置丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定,测出纯化的CDI为单一谱带,相对分子质量为27 000(图1)。
A示低分子量标准蛋白质 B示CDI
图1 CDI电泳
二、角膜缓释聚合物药丸的制备
4℃下10% Elvax(乙烯-醋酸乙烯酯聚合物,ethylene vinyl acetate copolymer,日本mitsui公司提供)溶于二氯甲烷,纯化的CDI和大肠杆菌内毒素(B4,美国Sigma公司)分别与其混合并强力搅拌至均匀悬液,悬液用消毒滴管滴入干冰预冷干燥的培养玻璃板小孔内聚合,凝固后放入-20℃冰箱静置24小时在达到完全聚合后,用眼科剪将聚合物剪切成1 mm×1 mm×1 mm的药丸,每丸重约(1.5±0.3) mg。按设计定量依上法制作4种含不同内容的角膜缓释药丸:(1)270 μg内毒素(15%)+400 μg CDI；(2)270 μg内毒素+200 μg CDI；(3)270 μg内毒素(即每丸内含内毒素15%)；(4)单纯10% Elvax丸。紫外线消毒后，置-40℃冰箱备用。
三、角膜缓释药丸的植入及分组
1.动物:新西兰兔32只(64只眼),每只体重约(2.5±0.5) kg(由上海第二军医大学实验动物中心提供)。随机分组：(1)CDI治疗Ⅰ组(18只眼),植入270 μg(15%)内毒素+400 μg CDI药丸，(2)CDI治疗Ⅱ组(17只眼),植入270 μg(15%)内毒素+200 μg CDI药丸；(3)270 μg(15%)内毒素组(17只眼)仅植入15%内毒素药丸；(4)空白对照组(12只眼),仅植入10%Elvax丸。
2.方法:全部兔以3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉,结膜囊内滴1%丁卡因表面麻醉。于角膜中央处横行切口3 mm长,深达1/2角膜厚度,用睫状体分离器向角膜6点钟位潜行分离形成角膜微袋,袋底距角巩缘2 mm。再以自制针形套管将不同内容药丸送至微袋底部,恢复角膜表面。局部涂金霉素眼膏(图2)。
1示角膜切口 2示睫状体分离器
3示套管植入药丸 4示植入丸位置
图2 兔角膜微袋及植入药丸示意
四、CNV的定量分析
1.动态定量分析:32只兔均于植入术后48小时用裂隙灯显微镜观察和测微计检测,以后隔日1次，共8次,全部检查均由同一人完成。每次均测定并记录自角巩缘长出的新生血管长度和数量,以连续弯曲度小，朝向植入物最长的新生血管为准。角膜新生血管生长面积按Robert电脑数学模型公式：C/12×3.141 6[r-(r-l)2]计算,其中C为发生新生血管的角膜圆周钟点数，r为角膜半径,l为血管长度[3]。
2.静态精确测定:术后第16天,在全麻下行兔颈动脉插管,肝素抗凝,同时将过量戊巴比妥钠经兔耳缘静脉注射处死,迅速自颈动脉注入平衡盐液灌洗至角膜缘血管无色后,用含11%明胶的10%墨汁灌注,观察见全部角巩缘血管网及新生血管充盈,立即局部液氮降温。取下角膜浸入10%甲醛缓冲液中,然后在放大镜下用测微尺精确测定血管长度及分布,计算面积并摄像，按比例放大5倍照片后进行对比分析。
五、组织形态学检查
角膜标本石蜡包埋,切片,HE染色。
六、统计学方法
计量资料以均数±标准差( ±s)表示,差异显著性采用方差分析检验。部分指标行相关分析。统计运算由统计程序包NCSS完成。P＜0.05为差异均有显著性意义。
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