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2泪液异常因素
结膜松弛症造成泪溢的主要原因：（1）松弛结膜机械性阻碍了泪液的流向。（2）松弛结膜直接堵塞了下泪小点开口处，使泪液排泄障碍。（3）松弛结膜早期反射性引起泪液分泌亢进[5]。1984年Bosniak等[6]首次提出结膜松弛症可引起流泪。1986年Liu[7]通过对15例结膜松弛症研究提出结膜松弛症患者流泪是由于松弛结膜影响泪河和/或堵塞下泪小点而引起。1990年Rieger首次报告结膜松弛症与干燥性角结膜炎之间关系[8]。1991年Gene[9]，1995年Hh等[10]也描述了结膜松弛症与干燥性角结膜炎之间有联系。张兴儒等对20例（40眼）结膜松弛症患者泪液学观察，结膜松弛症组与对照组Schirmer I试验和基础Schirmer试验比较，差异均无显著意义，P>0.05。虽然Schirmer test≤10mm者，结膜松弛症组18眼（45.0%）较对照组12眼（30.0%）多，但差异无显著意义（μ=1.386，P>0.05）。≤5mm者，结膜松弛症5眼（12.5%），也比对照组1眼（2.5%）多，但差异无显著意义（μ=1.6979，P>0.05）。在基础Schirmer试验中，结膜松弛组基础泪液分泌（8.70±5.05）较对照组（10.45±4.19）少。虽然差异无显著意义，但t值1.68，已接近统计学意义。≤5mm者，结膜松弛症14眼（35.0%）较对照组5眼（12.5%）多，差异有显著意义（μ=2.3645，P<0.01）。结膜松弛症泪液学改变可能是以基础泪液减少为主，但也存在反射泪液分泌增多的因素，可能是松弛结膜刺激眼表和睑缘引起反射泪液分泌增多。在临床上也观察到部分结膜松弛症患者早期出现流泪，后期不流泪，可能是后期已经耐受了松弛结膜的刺激或/和角膜、结膜的知觉敏感度下降，使反射性泪液分泌减少或/和反射性泌泪功能失代偿使反射泪液分泌减少[11]。结膜松弛症组与对照组泪膜破裂时间比较，差异有显著意义，P<0.05。可能是松弛结膜堆积在下睑缘影响泪河使泪膜形成异常，松弛结膜堆积在下睑缘也可能影响睑板腺分泌口分泌脂质、引起泪膜中脂质异常，造成泪液成分异常。泪液脂质层功能减退，泪液易蒸发，泪膜破裂时间缩短。在瞬目时，由于结膜过度松弛，上睑缘不能正常接触下睑缘，可能影响粘蛋白在眼表的分布，不能将粘蛋白正常带到眼表，粘液缺乏易影响泪膜的稳定性，引起泪膜的不稳定，BUT下降。虽然手术切除松弛结膜，使泪河恢复正常，但结膜松弛症手术前、后BUT比较，差异无显著意义，P>0.05。可能是结膜松弛症患者的泪液有量或质的异常。
松弛结膜堆积在眼球与下睑缘、内、外眦部之间形成皱褶，突出于眼表曲面，影响泪液的流动和泪河的形成。结膜松弛症组泪河异常者较对照组多，差异有显著意义，P<0.01。结膜松弛症手术后与对照组比较，差异无显著意义，P>0.05。手术切除松弛结膜后泪河得到明显改善。从下方球结膜和睑缘首先受损明显支持降解酶的来源是由于下穹窿部和泪湖部泪液的大量聚集，因此下方球结膜和睑缘首先受损。Jordan等用染色消失试验，观察结膜松弛症患者荧光素停留时间，发现存在功能性泪液排出阻塞的问题[12]。泪液清除的延迟而导致降解酶的大量堆积，在泪液中检测到了炎性细胞因子如白介素β1 和α肿瘤坏死因子等，这些因子可能引起球结膜中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase ,MMPS）MMP1和MMP3的过度表达，这种过度表达与蛋白质水平和蛋白分解活性增加有关。这就可以解释泪液清除延迟与炎症和结膜松弛症的形成相关。因此，泪液清除延迟导致了一个恶性循环，而结膜松弛症则可能是泪液清除延迟的另一个原因，它进一步加强了胶原纤维溶解。
泪液是一种复杂的生物复合体，其有形成分中90%以上为蛋白质，包括溶菌酶、各种免疫球蛋白、乳铁蛋白、补体系统等。我们应用Shotgun方法研究鉴定出的泪液蛋白质相对分子质量结膜松弛症组为4～4000kDa，正常对照组相为5～4000kDa，分子量分布范围基本相似。结膜松弛症组一共鉴定出356个蛋白质，正常对照组鉴定出352个蛋白质，两组之中有119个是相同蛋白质（包括已知的溶菌酶、分泌型sIgA、白蛋白、lipocalin、脂蛋白和免疫球蛋白等及一些泪液特异性蛋白质），其余的均为差异性蛋白质。高表达的蛋白质结膜松弛症组和正常对照组均有73个，但也有27个蛋白质差异。鉴定出的位于前10位的高表达蛋白质中结膜松弛症组出现两个乳铁蛋白（growthinhibiting protein 12和73 kDa protein）在正常对照组缺失，而正常对照组中一个免疫球蛋白（IGHA1 protein）在结膜松弛症组没有发现。在对两组泪液蛋白质GOA的生物过程分类，结膜松弛症组已知生物过程的蛋白质190个，未知蛋白质166个；正常对照组已知生物过程的蛋白质167个，未知蛋白质185个。其中在结膜松弛症组出现56个应激相关蛋白质，而正常对照组仅有43个。与炎症反应相关蛋白质结膜松弛症组有6个，而正常对照组仅有4个，其中结膜松弛症组中发现了特有的A1AG、S100钙结合蛋白A9，A1AG是炎症和组织损伤的急性反应物，它通过促进组织因子表达和单核细胞分泌肿瘤坏死因子α参与细胞炎症反应，A1AG和S100钙结合蛋白A9共同参与细胞炎症反应。结膜松弛症组具有调节凋亡相关的蛋白质有7个，而正常对照组只有3个；凋亡相关的蛋白质结膜松弛症组有12个，而正常对照组只有6个，其中结膜松弛症组中发现了特有的Caspase14前体和FAST激酶类似蛋白。Caspase14属于半胱氨酸蛋白酶家族，是一组引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。FAST激酶类似蛋白参与Fas介导的凋亡，Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活Caspase，导致靶细胞走向凋亡，结膜松弛症可能与细胞凋亡和炎症相关。结膜松弛症组与正常对照组比较有237个蛋白质差异，其中高表达的差异蛋白质有19个。对高表达的差异蛋白质功能进行数据库检索后发现大部分属于免疫球蛋白家族，一部分属于假想蛋白质，目前功能未知，但可能与结膜松弛症的发病戚戚相关。在低表达的差异蛋白质中，发现了结膜松弛症中所特有的一个蛋白质—防御素，是一类富含精氨酸的小分子多肽，主要由中性粒细胞、巨噬细胞和小肠潘尼细胞产生，对细菌、真菌和某些有包膜病毒具有直接杀伤作用。过去曾在翼状胬肉患者和眼外伤患者的泪液中发现过量表达，现在结膜松弛症中的发现进一步提示结膜松弛症与炎症相关。
我们应用ZipTipC18柱分离联合MALDITOFMS技术，分析结膜松弛症泪液蛋白表达谱的变化发现：22例结膜松弛症患者和13例正常对照组的泪液样品两组泪液的质谱检测峰的数量上没有明显的差异（P＞0.05）,但主成分分析显示结膜松弛症泪液蛋白质与正常对照组表达有差异，结膜松弛症组泪液蛋白质表现为“离群”样品，且离群分散度较大的样品为结膜松弛症Ⅳ级的患者。黏液的特征之一是在室温下干燥后，显微镜下呈现羊齿状结晶现象。Maragou等将泪液羊齿状试验检测作为干燥性角结膜炎（keratoconjunctivitis sicca，KCS）的诊断方法。Rieger和 Grene均报告过结膜松弛症与KCS之间的关系。Golding和Brennan在对泪黏液蕨样结晶的显微摄像研究中指出，泪液中盐类和高分子物质包括蛋白和黏蛋白是影响泪黏液蕨样结晶的决定因素。Golding应用X线和扫描电镜分析正常泪黏液蕨样结晶时发现，泪黏液蕨样结晶主要由NaCl、KCl及一些微量离子组成，高分子蛋白和黏蛋白则包裹在结晶表面，间接控制结晶形成。这进一步证实盐分子和高分子蛋白的比例是决定泪黏液蕨样结晶多少的重要因素。而结膜松弛症患者泪液蛋白质组的研究中发现结膜松弛症患者的泪液中在分子量为3375Da，3450Da未出现蛋白质峰。鉴于此，本研究通过泪液羊齿状结晶的改变观察其与结膜松弛症的关系。本研究结果显示，结膜松弛症泪液中羊齿状结晶明显减少，羊齿状结晶正常（Ⅰ级和Ⅱ级）仅占38.3%，Ⅲ级最多占到56.7%，Ⅳ级占5%。而正常对照组羊齿状结晶正常（Ⅰ级和Ⅱ级）占95.0%，Ⅲ级仅占到5.0%，未发现Ⅳ级表现。结膜松弛症与对照组比较差异有显著意义（P＜0.05）。随着结膜松弛症病程的加重，泪液中羊齿状结晶明显减少，差异有显著意义（P＜0.05）。Ⅰ级结膜松弛症羊齿状结晶正常（Ⅰ级和Ⅱ级）占93.3%，Ⅱ级结膜松弛症羊齿状结晶正常（Ⅰ级和Ⅱ级）占35.0%，Ⅲ级结膜松弛症羊齿状结晶正常（Ⅱ级）仅占10.0%，Ⅳ级结膜松弛症5眼均为异常，其中Ⅲ级占60.0%，Ⅳ级40.0%[13] 。
泪膜的稳定性是由脂质层、水液层、黏蛋白层以及泪液动力学等共同维持。本研究显示结膜松弛症患者泪液羊齿状结晶显著减少，TFT试验间接反映了泪液黏蛋白的功能，这提示泪液中黏蛋白的异常可能是导致结膜松弛症患者泪膜功能异常的重要因素。张兴儒等通过12眼结膜松弛症组与对照组用Cochet &Bonnet敏感度测试计（Luneau ophtalmologie）测量角膜、结膜及松弛结膜知觉敏感度进行配对t检验比较，发现结膜松弛症组角膜知觉敏感度较对照组下降t=2.388，P<0.05，差异有显著意义；结膜松弛症组结膜知觉敏感度较对照组下降t=2.209，P<0.05，差异有显著意义；结膜松弛症组松弛结膜知觉敏感度较对照组明显下降t=6.112，P<0.01，差异有非常显著意义。松弛结膜堆积在眼球与下睑缘、内、外眦部之间形成皱褶，突出于眼表曲面，影响泪液的流动和泪河的形成，甚至松弛的结膜直接堵塞了下泪小点开口处，使泪液排泄障碍。这使泪液中的代谢产物—一些致病因子的浓度和成分增加，而影响眼表感觉神经的阈值，引起眼表知觉敏感度的下降。或泪液清除延缓，泪液中的成分和浓度发生改变，影响眼表感觉神经，使得眼表知觉敏感度的下降，反过来角膜和结膜的知觉敏感度的下降，又影响泪液的分泌和瞬目运动[14]
为了客观评估结膜松弛症对泪液排泄系统的影响，张兴儒等对16例结膜松弛症组与对照组利用99mmTc—SPECT检查，这是一种在泪液排泄系统生理状态下的非侵犯性检查方法，不影响泪道的形态和功能，可显示泪液排泄系统何处有延缓淤积现象，能够提供定量分析指标。用10μL无菌生理盐水含有99mmTcO40.37MBq配制液，用微量注射器模拟反射泪液分泌途径轻柔滴于眼球外上方球结膜上。结膜松弛症组与对照组99mmTcO4—T1/2值比较，结膜松弛症组T1/2值(292±198)明显大于对照组(110±38)，差异有非常显著意义(t=3.58,P<0.01)。结膜松弛症组手术后T1/2值(245±115)较手术前明显缩短(356±189)，差异有非常显著意义(t=3.18，P<0.01)。相对客观地证实了结膜松弛症中泪液排泄系统功能不全，泪液排泄延缓。手术切除松弛结膜后解除了对泪液排泄系统的影响，患者的泪溢症状显著改善，室内观察溢泪改善，裂隙灯荧光素滴眼摄影动态观察泪河流动也支持上述结果。手术切除松弛的结膜后，术后4wk 16眼中8眼（50.0%）自觉泪溢完全治愈，7眼（43.8%）得到改善，其总有效达93.8%。术后4wk室内观察泪溢改善情况，16眼中13眼（81.3%）在10min内无泪液从睑裂溢出，而术前均观察到泪液溢出，从相对客观上判定，术后溢泪得到了明显改善。术后4wk裂隙灯观察结膜，16眼中14眼（87.5%）松弛结膜完全消除，泪河恢复正常。2眼（12.5%）残留松弛结膜，对泪液流向和下泪小点开口处均有影响，其原因是手术切除的结膜少，未能完全切除松弛结膜。溢泪治愈的病例主要是松弛结膜直接堵塞下泪点开口处，使泪液无法从泪小点排出的患者。切除松弛结膜解除对下泪小点的堵塞，泪液排出通畅，效果明显。99mmTcO4动态显像检查，显示在结膜松弛症中泪液排泄系统功能不全，泪液排泄延缓[15]。
3结膜松弛因素
成年后随着年龄增大球结膜变薄、弹性下降、张力减低。球结膜下的球筋膜组织逐渐萎缩，球结膜与其下方组织结合疏松，移动性增加，并且与巩膜的连接减退。1998年Meller等[16]提出了胶原纤维溶解可能导致了结膜松弛症的病理过程，弹力纤维的减少可能造成了结膜松弛症形成的病理生理假说。2000年Li等[17]报道了结膜松弛症与基质金属蛋白酶的过度表达和增生活跃有关在结膜松弛症的患者中可以观察到弹力纤维的变性。早期的文献曾记录到弹力纤维的退形性变化，但病理学资料显示不足且有矛盾。通过溶血素染色、伊红染色及Wright弹力纤维染色，没有发现弹力纤维的断裂或其他异常。弹力纤维变性在结膜睑裂斑、翼状胬肉以及其它皮肤衰老的病变中也有表现。弹力纤维变性被认为是由于光化学损伤引起的，也被发现同结膜松弛有关[18]。张兴儒等收集了17例结膜松弛症的松弛结膜组织，通过HE和Verhoeff弹力纤维染色，发现松弛结膜固有层中弹力纤维明显减少。用Masson氏三色染色和Mallory氏磷钨酸苏木素染色显示，部分患者出现固有层胶原纤维变性。临床表现提示胶原纤维溶解可能导致了结膜松弛的病理过程，这一推测为眼球表面的炎症现象所支持。可以推测，胶原纤维溶解和弹力纤维变性之间存在联系，其他眼表疾病，如：结膜睑裂斑和翼状胬肉也支持这样的联系。所以，弹力纤维变性和胶原纤维溶解的交替出现，导致了结膜松弛症的形成。
张兴儒等[19]研究发现结膜松弛症的结膜病理表现为结膜弯曲皱折，鳞状上皮明显增生，厚薄不均，角化不全，基底细胞轻重不等的色素沉着。固有层间质淤血水肿，淋巴、浆细胞浸润。固有层病变随临床分级的上升而加重，甚至有片状出血。弹力纤维染色示弹力纤维明显减少，几乎消失。对照组为随机年龄配对的单纯白内障手术患者。结膜表现为上皮5层以下，个别病例上皮轻度增生和少数基底细胞色素沉着。固有层变化不明显。与对照组比较结膜松弛症组上皮增生，基底细胞色素沉着，固有层淤血，炎细胞浸润，弹力纤维减少均显著。松弛结膜皱褶内血管弯曲、变形，瞬目时眼睑挤压松弛结膜容易引起血管的破裂而出现结膜下出血。结膜松弛症的上皮增生，基底细胞色素沉着、固有层淤血、出血及炎细胞浸润可能是结膜松弛症的继发性改变。而结膜固有层中弹力纤维明显减少可能是结膜松弛症发生的原因。弹力纤维减少可引起结膜弹性下降、张力降低、易于松弛，应视为结膜自身改变的主要发病原因之一。荧光素活体染色中，眼结膜松弛症组中异常者较对照组多，差异有显著意义，P<0.05。在松弛结膜上不能形成正常泪膜，而发生干燥、充血、水肿、失去光泽、上皮角化。同时结膜松弛症患者瞬目时下睑增加了与结膜、下方角膜的摩擦，造成微小损伤，角结膜荧光素点状染色。
张兴儒[20]利用透射电镜对结膜松弛症患者球结膜组织的超微结构进行对比观察，发现主要变化是成纤维细胞的功能状态不一样。结膜松弛症组的成纤维细胞的胞质中有较多中等程度扩张的粗面内质网和游离核糖体，胞质外周区有较多衣小泡和吞饮泡；而正常对照组成纤维细胞的粗面内质网未见扩张，衣小泡和吞饮泡较少，说明结膜松弛症成纤维细胞合成和分泌功能较对照组活跃。成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，除了合成和分泌胶原纤维、弹力纤维外，还合成和分泌许多细胞外基质（ECM）成分。目前认为成纤维细胞具有多种功能特性，同时在合成和调节细胞外基质成分中起着重要作用，有整合素等黏附分子的表达。在体外培养兔结膜成纤维细胞的实验中发现有多种因子可以抑制成纤维细胞。我们推测，结膜在体的成纤维细胞同样会受到各种各样因素的作用而影响其功能。结膜成纤维细胞功能状态的变化，必将导致这些细胞外成分的改变，影响了结膜固有层细胞外基质成分的平衡和稳定，可能又影响或/和加重了结膜形态结构的改变，使得结膜弹性进一步下降、张力降低，球结膜容易松弛下垂，而形成结膜松弛症。
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