【摘要】目的:βcatenin在正常的细胞粘附和wnt信号通路中发挥重要功能，本文探讨其在翼状胬肉组织及成纤维细胞中的表达及TGFβ1对其的影响。方法:通过组织块培养获取正常球结膜和翼状胬肉成纤维细胞并传至第4代，用10μg/L TGFβ1作用于细胞。抗βcatenin抗体对体内取出组织和培养的细胞行免疫组化染色；免疫印迹法检测培养成纤维细胞中βcatenin的表达情况。结果:免疫组化显示翼状胬肉成纤维细胞中βcatenin阳性着色强于正常结膜成纤维细胞。βcatenin在胬肉组织中较多，且多分布于上皮下纤维血管组织，上皮染色较少。体外培养见翼状胬肉成纤维细胞的生长较正常结膜成纤维细胞快、增殖能力强。免疫印迹法显示在翼状胬肉成纤维细胞蛋白中βcatenin的特异性阳性条带灰度值高于正常球结膜成纤维细胞蛋白。TGFβ1能促进翼状胬肉成纤维细胞中的βcatenin蛋白表达。结论:βcatenin在翼状胬肉组织及其成纤维细胞中的表达增高，提示βcatenin与翼状胬肉的发病有关。
【关键词】 翼状胬肉;成纤维细胞;βcatenin
catenin expression in pterygium fibroblasts
ZhuJuan Pan, YuHong Nie, MeiXia An, JingWen Liang, KaiLi Wu
Foundation items: National Natural Science Foundation of China (No. 30572002); Science and Technology Project of Guangzhou City, Guangdong Province, China (No. 2007J1C0101)
1 Zhongshan Ophthalmic Center, State Key Laboratory of Ophthalmology, Sun Yatsen University, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China; 2 Department of Ophthalmology, the First Peoples Hospital, Huanggang 438000, Hubei Province, China; 3 Department of Ophthalmology, Peoples Hospital of Xiaolan, Zhongshan 528415, Guangdong Province, China
Correspondence to: KaiLi Wu. Zhongshan Ophthalmic Center, State Key Laboratory of Ophthalmology, Sun Yatsen University, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To determine the expression of βcatenin in the primary pterygium and cultured pterygial body fibroblasts, and to discuss the effect of TGFβ1 on its expression.METHODS: Pterygial tissues were obtained from surgery and normal conjunctiva gotten from donor eyeball. Fibroblasts cells were cultured from primary pterygium and normal human conjunctiva, then, were subcultured to the fourth passage. Cultured cells were treated with 10μg/L of TGFβ1 for 24 hours. Expression of βcatenin in cultured cells, pterygial tissue and normal conjunctiva were examined by immunohistochemistry and Western blot.RESULTS: Pterygial fibroblasts (PFC) displayed a better proliferative activity than normal human conjunctiva fibroblasts (CFC) in the same culture condition. There was a higher βcatenin expression in the PFC than that in CFC in both immunohistochemistry and Western blot assays. TGFβ1 increased the expression of βcatenin in both PFC and CFC. Compared to normal human conjunctiva, the expression of βcatenin was more obvious in primary pterygium. βcatenin distributed in epithelium and fibrovascular tissue in pterygium, while in normal human conjunctiva it was mainly in epithelial cells. CONCLUSION: The expression of βcatenin increases in pterygium and in PFC. It suggests that βcatenin plays an important role in the pathogenesis of pterygium.
KEYWORDS: pterygium; fibroblast; βcatenin
前言
翼状胬肉是农村中老年人常见眼病之一，南方农村地区发病率高达30％以上[1]。目前翼状胬肉的病因仍不明了，缺乏有效地治疗方法。基因组学方法研究提示wnt信号通路可能与翼状胬肉的发病相关[2,3]。β连锁蛋白(βcatenin)是wnt信号通路的关键调控点，其功能包括在wnt通路中的信号传导作用和作为一种粘附分子，可以和Ecadherin结合并调节细胞粘附系统，影响细胞的粘附性和运动性。我们选择观察βcatenin在翼状胬肉组织/细胞中的表达及TGFβ1对其表达的影响，来探讨其在翼状胬肉发病机制中的作用。
1材料和方法
1.1材料
原发性胬肉组织来源于中山大学眼科医院手术患者，35~45岁，术前无特殊用药史。正常球结膜组织来自无眼疾的角膜移植供体眼。除部分组织用于细胞培养外，直接取部分正常及翼状胬肉组织进行HE染色和免疫组织化学染色。
1.2方法
(1)成纤维细胞培养：翼状胬肉及正常结膜成纤维细胞原代培养及纯化沿用本实验室之前所用方法[4]。取第4代细胞做为实验对象，相差显微镜观察两种细胞的增殖状况。部分待其生长至80％融合时，PBS洗3遍，加入含10μg/L TGFβ1（英国PeproTech EC 公司）的无血清DMEM培养液培养24h，对照组则加入无血清DMEM培养液常规培养24h。(2)免疫化学检测：将第4代翼状胬肉成纤维细胞及正常结膜成纤维细胞接种于底部放有盖玻片的六孔板中，培养至80%汇合，取出进行免疫细胞化学检测。同时也将翼状胬肉组织及正常结膜组织石蜡包埋切片进行免疫化学检测。两者的检测方法均采用SP法，按试剂盒说明书进行（福州迈新公司）。所用一抗为鼠抗人βcatenin多克隆抗体（美国Santa Cruz）。(3)免疫印迹法检测：免疫印迹法比较两种细胞之间和TGFβ1作用前后两种细胞中用βcatenin表达差异，方法同我们以前报道[5] 。一抗用鼠抗人多克隆抗体或鼠抗人GAPDH多克隆抗体 (上海康成)。用兔抗小鼠二抗及检测试剂盒进行化学荧光检测（PhototopeHRP Western blot检测试剂盒，美国cell signaling），GAPDH作为内参。
2结果
2.1培养成纤维细胞的βcatenin表达
体外培养的翼状胬肉成纤维细胞生长较正常结膜成纤维细胞快、增殖能力强，细胞总数多于正常结膜成纤维细胞。与之前本实验室报道的结果一致[4] 。在正常球结膜与翼状胬肉成纤维细胞中均有βcatenin的表达，以胞浆内为主(图1)。在翼状胬肉成纤维细胞中的染色较正常结膜成纤维细胞中的强。自正常球结膜与翼状胬肉成纤维细胞中提取总蛋白，经免疫印迹检测βcatenin蛋白的表达，在翼状胬肉成纤维细胞蛋白中βcatenin的特异性阳性条带灰度值均高于正常球结膜成纤维细胞蛋白(图2)。10μg/L TGFβ1作用24h后，能使培养的正常球结膜与翼状胬肉成纤维细胞中βcatenin蛋白的表达均增加。
2.2翼状胬肉组织观察
从HE染色片可看到胬肉组织上皮下纤维血管组织增生，可见较多的血管,大量红细胞存于其中，而正常结膜组织上皮下以纤维结缔组织为主，血管较少，红细胞也很少（图3 A,B）。在免疫染色中，胬肉组织中有βcatenin表达，且多分布于上皮下纤维血管组织，上皮染色较少；而在正常结膜组织中βcatenin表达相对较少，主要分布于上皮细胞膜处，上皮下纤维结缔组织中较少表达。与正常结膜相比，翼状胬肉中βcatenin的表达较多（图3 C,D）。
3讨论
翼状胬肉作为一种常见、缺乏有效药物治疗的疾病一直受到关注。在分析有关翼状胬肉的功能基因组研究结果中，我们发现wnt信号通路相关的基因在翼状胬肉的组织、上皮细胞或上皮下成纤维细胞中表达上调，提示wnt通路在翼状胬肉的发病机制中可能有重要作用。本文选择wnt通路中的βcatenin作为靶标，研究其在翼状胬肉组织及成纤维细胞中的表达及TGFβ1对其的影响[6]。结果观察到βcatenin在翼状胬肉成纤维细胞中表达增强，并主要分布于翼状胬肉上皮下纤维血管组织。Kase等[7]曾报道βcatenin翼状胬肉组织中表达增强，以上皮细胞明显，其中胬肉头部较体部多。Kato等[8]观察到胬肉组织上皮细胞核中β连锁蛋白的聚集及上皮下的纤维增殖，认为βcatenin的激活及基底上皮细胞基质化可能在翼状胬肉的发病中起一定作用。上述这些结果显示βcatenin可能与翼状胬肉成纤维细胞的增殖有关。
研究表明，翼状胬肉上皮下异常增生的成纤维细胞和新生血管是其主要的组织病理表现[913]。因此，许多研究应用成纤维细胞来探讨翼状胬肉的发病机制和寻找有效治疗药物[14,15]。本研究利用培养的成纤维细胞，观察到翼状胬肉成纤维细胞的增殖活跃，表达βcatenin较正常结膜成纤维细胞增强。已报道许多促进细胞增殖生长的细胞因子及其受体均在翼状胬肉中表达增强[3,16,17]。其中，TGFβ被认为与翼状胬肉的关系较紧密，羊膜移植可能通过下调TGFβ表达来抑制体外胬肉成纤维细胞增殖及体内抗疱痕作用[1820]。本研究发现外源性TGFβ1可以上调成纤维细胞中βcatenin的表达,且对来自翼状胬肉的成纤维细胞的作用较来自正常结膜的要强。而其作用机制可能是通过Smad3和p38 MAPK信号途径激活βcatenin介导的转录实现的[21]。本研究及文献报道显示，翼状胬肉组织中TGFβ及βcatenin表达均增强，可能两者在翼状胬肉的致病机制中有着协同作用。
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