【摘要】目的: 探讨链脲霉素（Streptozotocin,STZ）诱导的糖尿病鼠视网膜β-连环蛋白（β-catenin）表达以及与早期糖尿病视网膜病变发展的可能关系。方法: 建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型，用伊文思蓝检测视网膜血管的渗透性；免疫组织化学和Western blot方法检测糖尿病鼠视网膜及胰蛋白酶消化的视网膜微血管β-连环蛋白的表达情况。结果：糖尿病诱导4、8和12wk后视网膜血管渗透性分别增加68%、91%和125%（P <0.005）。免疫组化分析证实对照组视网膜β-连环蛋白主要表达在视网膜光感受器、外网状层、内网状层、神经节细胞层、内界膜及视网膜微血管内皮细胞和周细胞。STZ诱导糖尿病大鼠12wk后，视网膜及视网膜微血管β-连环蛋白表达显著增加。Western blot分析证明随着糖尿病视网膜病变的发展，视网膜β-连环蛋白表达显著增加。 结论：STZ诱导的糖尿病视网膜β-连环蛋白的表达增加，提示β-连环蛋白可能参与早期糖尿病视网膜病变的发生。

   【关键词】  β-连环蛋白　糖尿病　视网膜病变　Streptozotocin

　　Increased expression of β-catenin in the streptozotocin-induced diabetic rat retina

    Yang-Jun Li, Yan-Nian Hui, Yu-Sheng Wang

    PLA Eye Institute, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China

    Abstract AIM: To study the expression of β-catenin in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rat retina and the possible relevance of β-catenin in the early stage of STZ-induced diabetic retinopathy. METHODS: Vascular permeability was quantified by measuring albumin leakage from blood vessels into the retina using the Evans blue method. The model of STZ-induced diabetic rat was set up. β-catenin expression was measured in both normal and STZ-induced diabetic rat retinas and retinal microvessel using immunohistochemistry and Western blot analysis. RESULTS: Retinal vascular permeability was increased by 68%, 91% and 125% in the 4-, 8- and 12-week diabetic retinas, respectively, compared with that in the controls (P < 0.005). Immunohistochemistry showed the expression of β-catenin was detected and localized to the photoceptor, outer plexiform layer, inner plexiform layer, ganglion cell layer，internal limiting membrane and microvessel of rat retinas. However, the expression of β-catenin was significantly increased in STZ-induced diabetic rat retinas with the progression of diabetes. CONCLUSION: The increased expression of β-catenin in the retinas of STZ-induced diabetic rat may reflect that β-catenin participates in the development of diabetic retinopathy.

    · KEYWORDS: β-catenin; diabetes; retinopathy; streptozotocin

　　 0 引言

    糖尿病视网膜病变是引起糖尿病视力损害严重的并发症，也是重要的致盲眼病。其早期损害的标志是视网膜微血管周细胞凋亡、血视网膜屏障的破坏、血管渗透性增加和进展性的血管闭塞。目前详细的发病机制仍然不清楚。近来的研究发现，N-钙粘蛋白簇生在不同组织微血管内皮细胞和周细胞之间的黏附连接及视网膜组织，对内皮细胞和周细胞之间相互作用起关键的作用，且对血管的成熟和稳定起决定性作用[1-3]。β-连环蛋白（β-catenin）调控钙粘蛋白介导的黏附连结，钙粘蛋白的细胞质域羧基端结合到β-连环蛋白，依次与α-连环蛋白和肌动蛋白细胞骨架相联系。这些相互作用对正常的黏附系统的活性至关重要，因为β-连环蛋白对钙粘蛋白结构构成和功能方面起重要的作用。但是目前为止没有关于β-连环蛋白在糖尿病视网膜病变中的作用的相关证据。探讨β-连环蛋白在STZ诱导的鼠糖尿病视网膜中的表达及其对糖尿病视网膜病变的可能性作用可能有助于深入了解糖尿病视网膜病变的发病机制。

    1材料和方法

    1.1材料 糖尿病大鼠模型的建立，雄性S-D大鼠（第四军医大学实验动物中心），饥饿8h后称重量约重量约250±15g，随机分配到对照组（n =30），糖尿病组（n = 30）。大鼠分笼饲养，每笼4只，无限制的标准鼠食和水,饲养场所通风良好，室温18～25oC，相对湿度40%～70%，12h光照昼夜循环。大鼠禁食12h后，轻度麻醉(氯胺酮 40mg/kg),按70mg/kg剂量1次ip溶解在0.05mmol/L，pH4.5，灭菌枸橼酸盐缓冲液，含量为20g/L的STZ(Sigma公司)，使用前临时配置。注射7d后经大鼠尾静脉穿刺取全血检查空腹血糖，血糖＞15mmol/L以上者为糖尿病大鼠模型建立成功。正常大鼠接受1次ip 0.05mmol/L等体积枸橼酸盐缓冲液作为对照组。以后每周监测血糖和重量。

    1.2方法

    1.2.1视网膜组织切片和视网膜消化的准备 过量ip戊巴比妥钠处死大鼠，摘除眼球。40g/L多聚甲醛固定24h，0.01mol/L磷酸盐缓冲液冲洗24h，去除眼前节组织，分离视网膜。用于视网膜免疫组织化学的视网膜，常规行石蜡包埋，5μm厚的组织切片置于多聚赖氨酸处理的载玻片。用于微血管消化的视网膜，将磷酸盐缓冲液冲洗后的视网膜置于含有30g/L的胰蛋白酶的0.1mol/L Tris-HCL缓冲液，pH7.8，在37℃水浴中摇动，孵化2h后，再将其转到0.01mol/L磷酸盐缓冲液，吸出液体后再加入30g/L的胰蛋白酶的0.1mol/L Tris-HCL缓冲液消化直到血管清晰，用蒸馏水冲洗，洗去剩余的神经组织，将其置于多聚赖氨酸处理的载玻片上，室温空气中干燥，储存在-20℃备用。

    1.2.2视网膜血管渗透性测量 用伊文思蓝的方法测量血管渗透到视网膜血清白蛋白[4-5]。大鼠麻醉后，沿尾静脉注射30mg/kg伊文思蓝(Sigma公司)观察鼠全身变蓝，2h后打开胸腔，沿左心室注射10g/L，370C多聚甲醛柠檬酸液，压力为120mmHg，清除血管内的伊文思蓝，2min后摘除眼球，分离视网膜。将视网膜放入150μL甲酰胺，70℃孵育18h后提取伊文思蓝，7 000g，离心20min，取100μL上清测量在620nm的吸收率。据伊文思蓝标准曲线，用伊文思蓝（μg）/总蛋白浓度含量（μg）来计算伊文思蓝的含量。

    1.2.3免疫组化分析视网膜β-连环蛋白表达 石蜡包埋的视网膜组织切片常规二甲苯脱蜡，酒精逐级脱水，脱水后的视网膜组织切片PBS冲洗后用枸橼酸缓冲液微波法行抗原修复，抗原修复后的石蜡切片和视网膜微血管铺片用0.01mol/L冲洗，30g/L过氧化氢灭活内源性过氧化物酶活性后PBS冲洗。正常羊血清(Vector Laboratories Inc. USA)封闭30min，倾去多余，滴加1∶200兔抗β-连环蛋白一抗(Santa Cruz)，4℃过夜，PBS冲洗，滴加1∶1 000生物素化的羊抗兔二抗(Vector Laboratories Inc. USA)30min，PBS冲洗，滴加辣根过氧化酶结合的卵白素30min，PBS冲洗后，DAB(Sigma, St. Louis, MO, USA)显色。阴性对照组未加一抗。酒精脱水，二甲苯透明后封片。

    1.2.4 Western blot分析视网膜β-连环蛋白水平 分别在4、8和12wk麻醉后处死大鼠，摘除眼球，分离视网膜，在冰上切碎，液氮冷冻，-800C保存。Western blot前，将视网膜组织用10倍体积的组织细胞裂解液（含20mmol/L Tris-HCl, pH 7.4; 150mmol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 10ml/L Triton X-100; 5g/L sodium deoxycholate; 1g/L SDS; 0.2g/L sodium azide; 1mmol/L PMSF和 0.005g/L leupeptin）匀浆，16 000g离心20min，取上清，Bradford法测定蛋白浓度(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。等量的蛋白各25μg，用2倍浓度的等体积蛋白上样缓冲液，100℃加热5min，冷却到室温，把蛋白样品直接上样到8%SDS-PAGE胶加样孔内。在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳，用三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸-甲醇缓冲液将蛋白电转移到硝基纤维膜上1.5h后，用丽春红染色液染色。转膜完成后，在Western洗涤液中漂洗2min，吸尽洗涤液后，加入含50g/L的乳脂粉0.5g/L Tween-20 的 PBS封闭液在摇床上室温封闭1h。吸尽封闭液，加入1∶1 000的兔抗β-连环蛋白一抗(Santa Cruz)，4℃孵化过夜，膜用Western洗涤液在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5～10min。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5～10min。共洗涤3次。滴加1:1 000辣根过氧化物酶结合的羊抗兔IgG二抗(Vector Laboratories Inc. USA)，室温2h。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5～10min。共洗涤3次。用增强的化学发光试剂盒(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)分析，将所得的阳性条带进行光密度测定，光密度面积计算β-连环蛋白含量。

    统计学处理： 所有实验数据用 表示，用Premier 5.0统计分析软件，两组均数比较用t检验，P ＜0.05认为有显著差别。

    2 结果

    2.1大鼠体质量和血糖水平的变化 STZ诱导的糖尿病大鼠体重显著减轻与对照组相比(P ＜0.05)，12wk后糖尿病鼠体236±14.1g(n =30)。对照组数体质量为496±10.2g(n =30).（图1A）。STZ诱导的糖尿病大鼠血糖水平显著升高与对照组相比(P ＜0.05)，糖尿病诱导12wk后血糖为30.2±4.8mmol/L (n =30)，对照组血糖为4.9± 0.12mmol/L n =30)（图1B）。

    图1 STZ诱导的糖尿病大鼠体质量和血糖的变化

    2.2 STZ诱导的鼠视网膜微血管渗透性 视网膜血管渗透性测量用伊文思蓝方法。与对照组相比，糖尿病诱导4、8和12wk后视网膜血管渗透性分别增加68%、91%和125%。

    图2 糖尿病诱导的视网膜血管渗透性变化 图中N、D4、D8和D12分别代表对照组、糖尿病诱导后4、8和12wk视网膜血管渗透性。* P <0.005与对照组, **P <0.005与对照组和糖尿病4wk, ***P <0.005 与对照组和糖尿病4wk和8wk。

    2.3 STZ诱导的鼠视网膜 β-连环蛋白表达 免疫组化分析结果表明，STZ诱导的糖尿病大鼠12wk后，视网膜β-连环蛋白的表达较对照组显著增加，β-连环蛋白的免疫反应性主要分布在光感受器、外网状层、内网状层和神经节细胞层及内界膜（图3）。阴性对照组无表达。

    图3 视网膜β-连环蛋白表达SABC×200 A：对照组；B：糖尿病鼠12wk

    2.4 STZ诱导的鼠视网膜微血管N-钙粘蛋白表达 视网膜血管消化铺片免疫组织化学染色发现对照组视网膜血管表达β-连环蛋白，免疫组化染色分布在周细胞和内皮细胞（图4A）。STZ诱导的糖尿病大鼠3mo后视网膜血管消化铺片免疫组织化学染色β-连环蛋白表达显著增加（图4B）。

    图4 胰蛋白酶消化的视网膜微血管β-连环蛋白表达SABC×200 A：对照组B：糖尿病组

    2.5 STZ诱导的鼠视网膜 β-连环蛋白水平 为了进一步证明STZ诱导的糖尿病鼠视网膜在不同阶段β-连环蛋白水平的变化，Western blot分析结果显示糖尿病视网膜N-钙粘蛋白在4、8和12wk较对照组分别减少～13.2％, ～15.8％, ～35.1％（图5）。

    图5鼠视网膜β-连环蛋白分析 N、G4、G8、G12分别代表对照组、糖尿病4、8和12wk，条带的分子量为92kDa，β-actin 为内参照。*P＜0.05 与对照组相比

[1] [2] 下一页