3讨论

     本研究的目的是探讨HIF-1α在糖尿病大鼠角膜上皮细胞中的表达位置及表达量随时间变化的规律以确定其在糖尿病角膜上皮细胞病变发生及发展中的作用。结果显示糖尿病诱导成功后1wk角膜上皮细胞中即可发现HIF-1α阳性细胞，主要位于基底细胞的细胞核内。糖尿病4wk动物HIF-1α阳性细胞数量明显增加，6～10wk达到高峰，12wk开始下降。糖尿病大鼠角膜上皮细胞HIF-1α蛋白表达模式与免疫组织化学染色相似，1wk即有表达，4wk上升，6～10wk达到高峰，之后下降。HIF-1α是机体适应氧环境的主要调节因子。缺氧是其重要的激活因素。同时一些生长因子和细胞因子如胰岛素样生长因子－1（IGF－1）、内皮素－1（ET－1）、白细胞介素－1（IL－1）和胰岛素等非缺氧因素也是HIF-1α的激活因子[9]。角膜在糖尿病状态下处于缺氧状态，随着病程的延长缺氧会逐渐加重[7]。这可能是本文中HIF-1α在角膜上皮细胞中表达并且随病程延长表达逐渐增强的原因。缺氧状态下组织细胞HIF-1α表达的意义在于通过激活其下游基因如VEGF和EPO等基因的表达，减少缺氧对组织细胞造成的损伤。另外，实验研究发现糖尿病角膜上皮细胞中尤其是基底细胞中IGF-1和ET-1的表达显著高于非糖尿病角膜，这些因素也可能会促进糖尿病状态下角膜组织表达HIF-1α[7,10]。

     关于HIF-1α在糖尿病视网膜病变中的作用已有大量报道[8]，但是关于HIF-1α在糖尿病角膜病变中的研究未见报道。我们研究发现，HIF-1α在角膜上皮中的表达主要在基底细胞细胞核内，和缺氧状态下的表达位置一致[11]。但是HIF-1α在糖尿病进展过程中并不是持续高表达的，在经过6～10wk的高峰期后开始下降。造成这种现象的原因可能和糖尿病的高糖状态有关。因为高糖培养状态下人皮肤微血管内皮细胞比正常糖浓度培养细胞表达HIF－1α蛋白水平低，说明糖尿病高糖代谢紊乱状态可能会影响HIF－1α的反应[12]。缺血情况下，糖尿病大鼠心梗面积大于非糖尿病大鼠，同时心脏组织中HIF－1α的mRNA表达水平低于非糖尿病大鼠，也证明高糖对HIF－1α蛋白表达有抑制作用[13]。Makino等[11] 在正常大鼠角膜中发现角膜上皮细胞有低水平的HIF－1α的mRNA表达，而本实验中在各个时间点的正常大鼠角膜中都未发现HIF－1α蛋白表达。出现这种差异的原因可能和实验方法不同有关。

     VEGF是一个经过广泛研究的HIF－1α的下游基因。VEGF的重要作用是促进血管内皮细胞增殖从而诱导新生血管形成。在一些非内皮细胞中也发现了VEGF及其受体，如视网膜节细胞、视网膜色素上皮细胞、角膜上皮细胞和巨噬细胞等[7]。说明VEGF是一种重要的细胞存活因子[14]。糖尿病患者角膜上皮细胞VEGF的mRNA和蛋白水平均高于正常对照组[15]，这些高表达的VEGF可以减轻糖尿病对角膜上皮细胞的损伤[7]。由于HIF－1α是VEGF的重要调节因子，糖尿病状态下角膜上皮细胞中VEGF的上调可能和HIF－1α的高表达相关。早期糖尿病状态下角膜组织HIF－1α短暂高表达而不是持续高表达，可能会影响角膜上皮细胞VEGF的表达水平，降低角膜上皮细胞对糖尿病代谢紊乱损伤的适应能力，导致上皮细胞对手术、外伤等损伤的敏感性提高。糖尿病角膜上皮细胞病变的另一个重要特征是角膜上皮细胞黏附性下降[1]。细胞外基质及基底膜成分与其细胞表面的整合素受体之间的相互作用是决定细胞黏附的重要因素。通过对人角膜组织的研究发现糖尿病患者角膜上皮细胞表面整合素水平低于正常对照组[1]。HIF－1α有调节细胞表面整合素的作用，通过调节整合素的表达，促进细胞的黏附移行，在胎盘着床、肿瘤转移和白细胞浸润过程中起着重要作用[4-6]。大鼠角膜组织在糖尿病3mo后出现上皮细胞黏附松弛[16]，细胞表面整合素表达下降[17]，可能与3mo时HIF－1α表达下降有关。

     我们首次报道了在糖尿病状态下角膜上皮细胞中HIF－1α的表达规律，发现在早期糖尿病状态下，角膜上皮细胞HIF－1α表达短暂升高，说明HIF－1α在糖尿病状态下有适应性升高，但这种适应性反应是不充分的，不能提供足够的新生血管形成因子以减少组织的损伤，并且可能下调角膜上皮细胞表面整合素表达。同时说明在早期糖尿病状态下及时补充HIF－1α下游调节蛋白如VEGF可能有助于减轻糖尿病角膜上皮细胞病变的发展。

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