【摘要】  目的 探讨早期生长反应因子1（early growth response-1，Egr-1）在经H2O2损伤后的晶状体上皮细胞中的表达及其意义。方法 用SP免疫组化法测定经H2O2处理后2 h、8 h、24 h的晶状体上皮细胞中Egr-1的表达，用MAIS300图像分析系统测定其光密度值，采用t检验分析其在各时间点的表达水平。结果 在H2O2作用后2 h的晶状体上皮细胞中，Egr-1多为强阳性表达，平均光密度值为0.55±0.08；在H2O2作用后8 h的晶状体上皮细胞中，Egr-1多为阳性表达，平均光密度值为0.40±0.09；两组比较，差异有非常显著的统计学意义（P<0.01）。在H2O2作用后24 h的晶状体上皮细胞和对照组晶状体上皮细胞中，Egr-1未见表达，平均光密度值为0。结论 Egr-1在H2O2损伤后的晶状体上皮细胞中早期表达，可能为氧化损伤引起的白内障的早期反应之一。

   【关键词】  早期生长反应因子1；H2O2；免疫组化

    白内障的发生、发展与晶状体的氧化损伤密切相关，而H2O2在氧化损伤中占重要作用。体外晶状体培养和动物模型研究均证实H2O2可引起晶状体混浊，从而形成白内障，故本实验用H2O2处理体外培养的兔晶状体上皮细胞，来制造对晶状体上皮细胞的氧化损伤。早期生长反应因子1（early growth response-1，Egr-1）属即刻早期基因家族一员，是一种与凋亡相关的基因。本研究用SP免疫组化法测定在经H2O2处理后的晶状体上皮细胞中Egr-1的表达，以探讨Egr-1在氧化损伤引起的白内障中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  试剂与材料  Egr-1兔多克隆抗体（武汉博士德生物有限公司），DHA显色剂、SP试剂（北京中杉金桥生物有限公司）。DMEN培养液、胚胎牛血清（美国Gibco公司）。兔晶状体上皮细胞系N/N1003A（由中国医学科学院基础医学细胞中心提供）。

    1.2  H2O2对兔晶状体上皮细胞的处理  使用DMEN 细胞培养液和优质胎牛血清，于37℃、5％CO2下培养兔系晶状体上皮细胞。将72片已消毒的20 mm盖玻片置于12块六孔板培养皿中，按2×104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，用于实验。

    1.3  实验分组  5 d后将12块六孔板（72个标本）随机分为实验组和对照组，每组6块（36个标本）。实验组置于H2O2浓度为200 μmol/L的培养基中2 min，对照组仍然用原培养液培养。2 h后用PBS液清洗实验组细胞标本，仍将实验组放于原培养液中培养2 h、8 h、24 h，然后对实验组以及对照组各时间段的标本进行免疫细胞组织化学染色鉴定。

    1.4  SP免疫组化法  用PBS液清洗标本3次，各 1 min，4％多聚甲醛固定15 min，空气干燥5 min。PBS液清洗标本3次，各2 min，0.5%Triton X-100(PBS配)孵育1次20 min。PBS液清洗标本3次，各2 min，3% H2O2孵育15 min。PBS液清洗标本3次，各2 min，封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20 min。一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4℃过夜，PBS液清洗标本3次，各5 min。二抗工作液孵育（湿盒）37℃下30 min，PBS液清洗标本3次，各5 min，C液（湿盒）37℃下30 min。加DHA显色剂室温下显色10~20 min，在光学显微镜下观察，适时用大量自来水冲洗干净，终止显色。常规逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜观察并照相。设置阳性和阴性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

    1.5  免疫组化显色判断及主要细胞定量分析  经DAB显色后，根据晶状体上皮细胞内Egr-1着色程度，将阳性细胞分为3个等级：细胞内着浅棕色颗粒为弱阳性，棕色颗粒为阳性，深棕色颗粒为强阳性。每张切片随机取5个视野，用MAIS300图像分析系统测定每个视野的平均光密度值，取其平均值，最后计算每组样本的平均光密度值。

    1.6  统计学方法  采用SPSS统计软件，两组间比较采用独立样本t检验。

    2  结果

     免疫组化结果显示，对照组：各时间段晶状体上皮细胞中的Egr-1未见表达（见图1），平均光密度值为0。实验组：经H2O2处理后2 h，晶状体上皮细胞中Egr-1多为强阳性表达，胞浆、胞核均见表达(见图2)，平均光密度值为0.55±0.08；经H2O2处理后8 h，晶状体上皮细胞中Egr-1多为阳性表达，以胞浆表达为主（见图3），平均光密度值为0.40±0.09；经H2O2处理后24 h，晶状体上皮细胞中Egr-1未见表达（见图4），平均光密度值为0。H2O2作用后2 h和作用后8 h晶状体上皮细胞中Egr-1蛋白表达的平均光密度值相比，差异有非常显著的统计学意义（P<0.01），见表1。

    3  讨论

     早期生长反应因子1（early growth response-1，Egr-1）属即刻早期基因家族一员，是一种重要的核转录因子，各种应激如生长因子、细胞因子、缺氧、物理作用、损伤等都可以迅速引起Egr-1的表达。其编码的蛋白质产物Egr-1蛋白是一种含锌指结构的转录因子，能与多种下游基因的启动子区域相结合，上调或下调基因的转录，从而参与调节细胞的生长、分化、增殖、凋亡。目前该因子在心血管系统、消化系统、神经系统、肿瘤等方面已有大量研究，但在白内障方面的研究较少。Nakajima和Belusko等[1-2]用12 d的SD大鼠在上皮下注射亚西酸钠（30 μmol/kg），取第1天和第3天的大鼠晶状体囊膜，用PCR测定基因表达的变化，发现Egr-1的基因表达分别增加为5.6倍和15.4倍，证明了Egr-1在硒性白内障上有表达。但目前还没有研究证明Egr-1在除硒性白内障外其他类型的白内障上是否也有表达。本试验用H2O2处理体外培养的的晶状体上皮细胞，然后用免疫组化方法测定Egr-1蛋白的表达，结果表明：Egr-1在经H2O2处理后2 h的晶状体上皮细胞中多为强阳性表达，胞浆、胞核均见表达；经H2O2处理后8 h，晶状体上皮细胞中Egr-1多为阳性表达，以胞浆表达为主；经H2O2处理后24 h，晶状体上皮细胞中Egr-1未见表达。实验结果说明，Egr-1在经H2O2处理后的体外培养的晶状体上皮细胞中有表达，而且是早期表达。又因为H2O2对晶状体上皮细胞的作用主要是氧化损伤，因此，我们推测Egr-1在氧化损伤导致的白内障晶状体上皮细胞中有表达，可能为氧化损伤所导致的白内障的早期反应之一。

    Egr-1是一种与凋亡密切相关的因子。目前研究已经证明Egr-1可以通过激活野生型P53[3]和增加细胞内钙离子浓度，激活肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）[4]、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）[5]，下调B细胞淋巴瘤/白血病2（B cell lymphoma/ewkmia-2，bcl-2）[6]等以及survivin基因[7]几条途径来促进细胞凋亡。而TNF-α、bcl-2[8]、TGF-β[9]等都被证明可以使晶状体上皮细胞的凋亡增加，而目前我们认为晶状体上皮细胞凋亡是氧化损伤所致白内障发生的细胞学基础。因此，我们推断Egr-1在氧化损伤所致的白内障中的可能作用机制为：H2O2引起晶状体上皮细胞Egr-1的迅速表达，而Egr-1通过调控下游基因的表达，进而导致晶状体上皮细胞凋亡的发生，从而导致白内障的发生。但具体的途径以及Egr-1是否在其他类型的白内障中仍有表达需要进一步研究。

   【参考文献】
 
[1] Nakajima T， Nakajima E， Fukiage C. Differential gene expression in the lens epithelial cells from selenite injected rats[J].Exp Eye Res，2002，74（2）：231-236.

[2] Belusko PB， Nakajima T， Azuma M1. Expression changes in mRNAs and mitochondrial damage in lens epithelial cells with selenite[J]. Biochim Biophys Acta，2003，1623(2-3)：135-142.

[3] Das A， Chendic D， Dev S. Ionizing radiation down-regulates p53 protein in primary Egr-1-/- mouse embryonic fibroblast cells causing enhanced resistance to apoptosis[J]. J Biol Chem，2001，276(5)：3279-3286.

[4] Ahmed MM， Sells SF， Venkatasubbarao K， et al. Ionizing radiation inducible apoptosis in the absence of p53 linked to transcription factor EGR-1[J]. J Biol Chem，1997，272(52)：33056-33061.

[5] Lee CG， Cho SJ， Kang MJ. Early growth response gene 1-mediated apoptosis is essential for transforming growth factor beta1-induced pulmonary fibrosis[J]. J Exp Med，2004，200(3)：377-389.

[6] HuangR P， Fan Y， Peng A， et al. Suppression of human fibrosarcoma cell growth by transcription factor Egr-l involves down-regulation of Bcl-2[J]. Cancer，1998，77(6)：880-886.

[7] Waqner M， Schmel K， Dorker B. Transcriptional regulation of human survivin by early growth response(Egr)-1 transcription factor[J]. Int J Cancer，2008，122(6)：1278-1287.

[8] Mao YW， Xiang H， Wang J. Huaman Bcl-2 gene attenuates the ability if rabbit lens epithelial cells against H2O2—induced apoptosis through downregulation if the alpha cysstsllene gene [J]. J Biol Chen，2001，276(46)：43435-43445.

[9] Maruno KA， Lovicu FJ， Chamberlair CG. Apoptosis is a feature of TGF-β induced cataract[J]. Clin Exp Optom，2002，85(2)：76-82.