3  讨论

    3.1  MMPs与POAG的关系  POAG是主要的致盲眼病之一，其发病机制尚未完全阐明，眼压升高及其视神经损害是其主要特征。许多学者发现POAG患者小梁网中细胞外基质异常堆积，如：弹力样纤维鞘源性物质、弹力蛋白、纤维连接蛋白增多[5]。

    MMPs属于Zn2＋依赖性内肽酶家族，在自然生理和病理过程中的细胞外基质降解过程中发挥重要作用。MMPs家族成员目前有25个，而且仍有新成员不断加入。根据底物的特异性的不同分为5大类[6]：①胶原酶。②明胶酶。③基质溶素。④膜型。⑤其他MMPs。其中MMP-3是一种基质溶素，可降解包括Ⅲ，Ⅳ，Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅸ，Ⅹ 型胶原、层黏连蛋白、蛋白多糖和纤维连接蛋白等在内的许多ECM成分，在胚胎发育和组织塑型中起着不可取代的作用[7]；MMP-9又名明胶酶B，具有降解变性胶原分子及天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原的活性，其抑制剂为TIMP-1和TIMP-2。

    近年来的研究表明，生理状态下房水中的MMPs与TIMPs可能绝大多数来源于血液，部分来源于角膜、睫状体和小梁网等周围组织细胞，其中包括MMP-1，MMP-2，MMP-7，MMP-9和TIMP-1，TIMP-2[8]。实验和临床研究表明，POAG时MMPs有不同程度的表达及活性的改变。Schl?觟tzer-schrehardt等[9]应用Western印迹法、特异免疫分析法、zymography法分析来自POAG患者的房水标本，检测出MMP-2，MMP-3，MMP-7，MMP-9，MMP-12和TIMP-1，TIMP-2，并且TIMPs的含量超出MMPs含量的6~7倍，而内源性激活的MMP-2的水平显著下降。Bradley等[10]在人类器官外植块灌注模型中，在灌注介质中加入等量的活化的MMP-3和MMP-2，MMP-9，房水流出通畅率增加160%。相反，当灌注介质中加入TIMP-2，灌注量将比处理前减少40%。这些研究表明房水中局部MMP-TIMP平衡的改变及MMP活性的降低可能增加小梁网异常的细胞外基质的堆积，增加房水流出阻力，这可能涉及POAG的发病机制。

    3.2  TNF-α、MMP-3和MMP-9与POAG的关系     TNF-α主要有激活的单核-巨噬细胞分泌，但T细胞、B细胞、NK细胞、LAK细胞均可低水平表达TNF-α。在眼表，TNF-α主要来源于淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和上皮细胞[11]。Leonardi等[12]研究发现TNF-α能显著增加体外培养的结膜成纤维细胞MMP-1、MMP-9和TIMP-1的生成。另有发现TNF-α能上调体外培养的视网膜微血管内皮细胞MMT-MMP和MMP-9的表达，启动了视网膜微血管的形成[13]。有研究表明人眼小梁细胞分泌细胞因子TNF-α，正常房水中TNF-α的浓度保持在动态平衡中，其浓度的改变可引起疾病[14]。Samples等[15]用RT-PCR方法在小梁组织和体外培养的小梁细胞上检测到TNF-α受体存在，并且在给予外源性的TNF-α后能促进小梁细胞的增殖。激光小梁成形术（laser trabeculoplasty，LTP）是治疗POAG的一种有效的方法，术后发现房水的流出率增加，同时房水中的TNF-α分泌增加，推测两者之间存在相关性，即激光小梁成形术可能通过诱导增加细胞因子TNF-α、IL-β分泌来增加小梁的MMPs家族尤其是MMP-3及MMP-9的表达，潜在地增加ECM的降解，导致ECM从小梁间隙清除，房水流出增加[16]。但是目前发现激光小梁成形术的治疗效果不是永久性的，只能改善高眼压的症状，不能治愈此症。因此LTP→TNF-α、IL-β→MMPs→ECM→小梁网房水流出通路的研究成为热点。

    本实验研究采用RT-PCR半定量分析法和酶谱定量分析法从mRNA、蛋白质和基质金属蛋白酶的活性水平对TNF-α加强房水小梁网流出通路的机制进行体外研究。与先前从细胞内MMP-3，MMP-9蛋白水平检测结果一致，即体外培养人眼小梁细胞表达MMP-3及MMP-9，外源性给予TNF-α可促进小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达，并且呈现剂量依赖性[11]。目前对于启动MMP-3和MMP-9表达的信号转导上游信号通路的研究日益受到关注。Alexander等[17]发现细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，Erk）—丝裂原活化蛋白（mitogen-activated protein，MAP）激酶信号转导途径涉及TNF-α对MMP表达的作用。特异性Mek抑制剂能阻断TNF-α诱导的MMP表达和Erk的磷酸化作用。Hosseini等[18]发现TNF-α处理小梁细胞能影响JNK信号途径的元件，JNK信号途径的激活诱导MMPs的表达，进而降低眼内压。可见 TNF-α在调节小梁细胞分泌MMPs过程中有JNK-MAPK和ERK-MAPK信号转导途径的参与，为青光眼的靶向治疗提供了方向。

    3.3  ＮＦ-κＢ在TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9表达影响中的作用  ＮＦ-κＢ是普遍存在于细胞浆中，以p50/p65异二聚体为形式的一种快反应转录因子，几乎存在于体内所有细胞中，且含量最高，此异二聚体与ＮＦ-κＢ的抑制蛋白（inhibitor kappa B，IκＢ）结合形成无活性状态的三聚体 。此异三聚体可以被多种刺激剂，如TNF-α，IL-1、神经生长因子、蛋白激酶C激活剂，有丝分裂原、氧化剂、细菌、病毒、免疫刺激剂、脂多糖、自由基、紫外线等激活[19-21]。激活后的ＮＦ-κＢ与IκＢ分离，转位进入胞核与靶基因启动子/增强子上的κＢ位点结合，从而调节靶基因的表达，因此被称为控制早期基因表达的开关。研究发现许多胞内核因子kappa B的活化信号都通过不同的途径汇聚于一种高分子寡聚蛋白，即丝氨酸特异性IκＢ激酶IKK。所以ＮＦ-κＢ活化的共同途径是IκＢ激酶IKK→ＮＦ-κＢ/抑制因子IκＢ→活性ＮＦ-κＢ。由ＮＦ-κＢ调节的靶基因编码蛋白至少包括：细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、黏附分子和急性期蛋白等。

    PDTC是一种抗氧化剂，是ＮＦ-κＢ特异性的抑制剂，主要功能有两方面，一方面是抑制ＮＦ-κＢ的P65亚单位，抑制ＮＦ-κＢ活化；另一方面，PDTC是金属螯合剂，可螯合一些二价阳离子，如：Zn2+，Mn2+，Mg2+等。本实验中发现在TNF-α 10 ng/ml和25 ng/ml处理组，提前30 min加入PDTC，RT-PCR、酶谱技术检测显示MMP-3，MMP-9的表达较未加入PDTC处理组明显降低，但MMP-3，MMP-9仍有表达，未被完全抑制，这说明在TNF-α上调MMP-3和MMP-9表达的信号转导中除了有ＮＦ-κB参与外，还有其他转录因子的参与。虽然对于启动MMP-3和MMP-9表达的机制目前还不是很清楚，但是在对于平滑肌细胞的研究发现是在ＮＦ-κB和AP-1的协同作用下上调MMP-1，MMP-3，MMP-9的表达[22]。

    因此我们可以推论，刺激ＮＦ-κB的活化可以增加HTCs的MMP-3和MMP-9的表达，房水中有活性的MMP-3和MMP-9增加，小梁网中异常堆积的ECM降解增加，房水流出增加，达到降低眼压，取得和激光小梁成形术相似的疗效，这有赖于对启动MMP-3和MMP-9转录的机制的进一步了解，为临床POAG的治疗提供新的思路。

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