【摘要】  目的 观察神经生长因子（nerve growth factor， NGF）滴眼液对兔眼准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratomileusis， LASIK）后角膜神经修复的影响。方法 35只中华大耳白兔双眼接受近视性 LASIK术，术后左眼用配置的100 ?滋g/ml NGF滴眼液，右眼滴平衡液（balanced salt solution，BSS）作为对照，1滴/次，3次/d。分别于术后第1天、第3天、第1周、第2周、第1个月、第3个月、第6个月各取5只兔，在观察双眼前后节反应后处死兔，摘除双侧角膜，进行角膜神经氯化金染色。光镜下观察LASIK术后角膜神经修复过程，分别比较角膜上皮、浅基质层，深基质层NGF组与BSS组LASIK术后不同时期角膜神经的数量。结果 LASIK术后角膜深基质层、角膜瓣连接处的上皮下和浅基质层神经未受损，瓣切削处上皮下和浅基质层神经消失。术后不同部位的角膜神经再生程度不同，术后第6个月周边部角膜神经形态已接近正常，角膜中央仍无神经分布。NGF组与BSS组术后各时间点角膜上皮、浅基质层神经数量比较，NGF组大于BSS组，差异有显著性（P<0.05）；两组术后深基质层神经数量比较，NGF组大于BSS组，差异也有显著性（P<0.05）。结论 NGF滴眼液对LASIK术后不同部位、不同时期角膜神经的修复有明显促进作用。

   【关键词】  角膜磨镶术 激光原位/方法 兔 神经生长因子 角膜神经 神经再生

    准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratomileusis，LASIK）仍是目前角膜屈光手术中的主流术式，术后干眼症是影响术后视觉质量及患者满意度的主要因素[1-2]。有研究认为，引起LASIK术后干眼症的主要原因是术中不同程度地损伤了角膜神经，影响了角膜的知觉[3]，继而导致泪液分泌动力学和泪膜的稳定性下降。一些研究结果显示LASIK术后角膜神经修复需要漫长的时间[4-5]。本研究将神经生长因子（nerve growth factor， NGF）针剂配置成滴眼液，观察其对LASIK术后不同部位角膜神经修复的影响，寻找可能促进角膜神经修复的方法，为开发适合临床应用的促进角膜神经修复药物提供依据，进一步提高角膜屈光手术后的视觉质量。

    1  材料和方法

    1.1  LASIK动物模型眼的制备  取眼部检查正常的健康中华大耳白兔35只（由南通大学实验动物中心提供，体重2~3 kg，雌雄兼备，普通级）。用20%乌拉坦腹腔注射麻醉（1.5 ml/kg体重），麻醉起效后，用不透水塑料袋包裹动物，暴露头部，剪掉眼睑周围较长睫毛，滴0.5%爱尔凯因表面麻醉2次。用无齿镊和纹式钳轻轻上提眼球至脱臼状态，术中用纹式钳在眼球后稍加固定（避免钳夹视神经），+2号负压固定环吸附眼球，Moria-M2角膜刀制作130 ?滋m厚角膜瓣，掀开角膜瓣做激光切削（Allegretto Wave 1008鹰视准分子激光机，切削直径6 mm，切削量20 ?滋m）， BSS液冲洗，角膜瓣复位[6]。

    1.2  神经生长因子滴眼液的配置与使用  恩经复粉剂（注射用鼠神经生长因子，由厦门北大之路生物工程有限公司惠赠），6000 Au（12 ?滋g）/支，用平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）稀释成100 ?滋g/ml的透明澄清水溶液，磷酸盐缓冲液调整pH值至7.3~7.5之间，过滤法除菌，分装放入4℃冰箱中备用。自LASIK术后第1天起，左眼滴NGF滴眼液，右眼滴BSS液，1滴/次，3次/d，直至模型处死。

    1.3  眼部观察  在LASIK动物模型建立后及滴眼液使用过程中常规进行裂隙灯和眼底镜检查并测定眼内压。

    1.4  角膜组织标本的采集与染色  分别于术后第 1天、第3天、第1周、第2周、第1个月、第3个月、第6个月下午5时各取5只兔，在观察眼前后节反应后行耳缘静脉空气栓塞处死，立即摘出双侧眼球，剪下角膜，用4%甲醛液固定12 h后，将角膜撕成 3片，分别标记为角膜上皮及浅基质层、深基质层、残留基质及内皮细胞层，并将角膜上皮及浅基质层和深基质层角膜平分成4个象限，置入1%氯化金水溶液中30 min，入酸化水中浸泡10 h（酸化水的配制为每100 ml蒸馏水中用滴管加冰醋酸6滴）。按浓度梯度依次入70%、90%、100%的乙醇中脱水各2 min，二甲苯透明2次，每次3 min，中性树胶封片。组织玻片在双目光学显微镜下观察角膜神经，电脑控制下摄像。

    1.5  角膜神经的计数  以角膜片中心3 mm半径做标记，标记以内设为角膜中央区，以外设为角膜周边区，采用随机双盲法分别记录中央区、周边区LASIK术前、术后各时间点新生角膜神经的数量。

    1.6  统计学方法  STATA 7.0统计软件进行分析。用t检验比较：①NGF滴眼液组与BSS对照组LASIK术后角膜上皮和浅基质层再生神经纤维数量的变化。②NGF滴眼液组与BSS对照组LASIK术后角膜深基质层再生神经纤维数量的变化。

    2  结果

    2.1  LASIK术后角膜神经的变化及其比较  LASIK术后角膜上皮和浅基质层NGF组与BSS组各时间点新生神经纤维的数量见表1，其中，术后第1天、第3天角膜上皮和浅基质层尚没有新生的神经纤维。深基质层NGF组与BSS组各时间点新生神经纤维的数量见表2，其中，术后第1天角膜深基质层尚没有新生的神经纤维。

    术后第1天，NGF组与BSS组深基质层神经断端和角膜瓣缘外的上皮和浅基质层神经断端轻度增粗，各神经断端均无神经纤维再生（见图1）。

    术后第3天，NGF组与BSS组深基质层神经断端以出芽方式发出细微的新生神经纤维芽（见图2），角膜瓣缘外角膜上皮和浅基质层神经断端无明显神经再生。NGF组深基质层神经断端的新生神经纤维芽较BSS组数量稍多。

    术后第1周，NGF组与BSS组深基质层神经断端出芽方式发出细微的新生神经纤维芽数量均增多，NGF组增多较BSS组明显；NGF组与BSS组角膜瓣缘外的角膜上皮和浅基质层神经断端出现数个极其微小的神经纤维，NGF组再生神经纤维数量增多较BSS组明显。

    术后第2周，NGF组与BSS组深基质层神经断端、角膜瓣缘外的上皮和浅基质层神经断端的再生神经纤维直径和长度均有明显增加，NGF组再生神经纤维数量增多较BSS组明显。

    术后第1个月，NGF组与BSS组深基质层神经断端均已发出数条侧枝，新生的神经侧枝直径较细，弯曲度增大，相互形成侧枝吻合，其中一些分支已达浅基质中层，新生的神经纤维较正常神经直径纤细，分支增多；角膜瓣缘外上皮和浅基质层神经断端有更多神经纤维向角膜中央生长，NGF组上皮和浅基质层新生神经纤维数均较BSS组多。

    术后第3个月，NGF组深基质层神经侧枝与断端神经形成的网状结构密度较高，神经纤维较正常分支增多，弯曲度加大，一些分支已穿过浅基质层与上皮下神经丛相连接。角膜瓣上皮层神经的网状结构环行围绕在角膜中央，周边区与来自基质层的再生神经吻合；BSS组深基质层神经侧枝与断端神经吻合，一些分支与上皮层神经丛相连接，神经网状结构较NGF组稀疏，角膜瓣上皮层神经的网状结构局限于角膜周边部，无论是深基质层还是上皮和浅基质层，新生神经纤维数量NGF组较BSS组均增多。

    术后第6个月，NGF组与BSS组周边区基质层再生的网状神经均与上皮层神经丛吻合，连接形成网状，部分神经纤维的断端没有神经再生，形成盲端。NGF组周边部角膜神经形态已恢复至术前密度（见图3），BSS组周边部角膜神经密度较术前低（见图4），但两组再生神经纤维均未延伸至角膜中央，NGF组角膜中央无神经分布区面积明显小于BSS组（见图5、图6），NGF组深基质层及上皮和浅基质层新生神经纤维数量均多于BSS组。

    2.2  NGF滴眼液使用过程中的眼部变化  LASIK术后6个月内NGF滴眼液滴眼未出现结膜充血、角膜缘新生血管、角膜上皮细胞剥脱、基质层水肿、晶状体混浊、玻璃体混浊、视网膜改变和眼内压波动等并发症。

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