活体染色在眼表疾病的临床应用

    肖光礼 吴亮

　　【摘要】　活体染料如荧光素钠、虎红、丽丝胺绿是眼表疾病临床诊断的重要工具，目前已广泛用于眼表疾病的诊断、评估疾病的严重性及治愈情况等。每种染料具有独特的化学结构和性质，了解这些活体染料的功能和用途对眼科临床十分必要的。本文对活体染料的历史及其在眼表疾病的应用近况进行概述。

　　【关键词】　活体染料；活体染色；眼表疾病

　　一、活体染料的历史回顾

　　活体染色(vital staining)是指用活体染料(vital dyes)对人或动物的活体组织或细胞进行染色。能够染色活体细胞和组织的染料称为活体染料，它们通常是含有发色基团和苯环结构助色基团的有机化合物。发色基团决定了染料的颜色，助色基团决定染料的染色能力。

　　染料通常分为两类：天然的和人工合成的。众所周知的天然染料如洋红(carmine)、靛蓝(indigo)早在19世纪就用于生物组织染色。1856年由苯胺制备出第一组人工染料，此后不久人工合成的染料远远多于天然染料。大多数用于生物染色的人工染料，是通过来自煤焦油的一种或多种化合物经过化学方法制备而成。起初生物染色的原因是由于在显微镜下染色的组织比不染色者更易观察。人工染料尤其是苯胺染料常用于活体染色。活体染色的机制包括化学和物理理论，化学理论认为是染料通过化学反应方式与组织结合，固定组织；物理理论则强调染料通过毛细血管或通过渗透、吸收的方式进入组织或细胞。

　　最初的活体染色主要源自生物学者的兴趣和实验室工作。1882年Pfluger报告了用荧光素钠测定损伤角膜上皮细胞的完整性，此后荧光素钠染色逐渐成为眼科医师检测角膜损伤及愈合情况的重要工具。在眼科水溶性染料用于角膜和结膜染色是非常成功的，这些染料包括荧光素钠、虎红、丽丝胺绿B及其他一些染料。

　　早期文献中对染料的命名十分混乱，许多染料具有多种名称，而同一染料在成分、纯度、溶解度、颜色方面也存在较大差异。染料的纯度直接影响其溶解度、染色效果及对眼的刺激性，这就解释了为什么不同作者用同一染料在角膜、结膜染色中报告出不同结果。1923年在北美成立了“生物染色委员会(Biological Stain Commission)”，通过对生物染料的鉴定和规范，改进了这些不足。1960年该委员会已确认和标准化了57种染料，对同一种染料编排了惟一的颜色索引号码(Color Index，C1)，并命名染料的通用名称。此外，该委员会还根据染料的发色基团进行分类，将具有相似化学结构的染料分在同一组。据此分类方法，荧光素钠和虎红归于咕吨类染料的荧光衍生物组，丽丝胺绿B归于甲苯的联苯—萘基苯的衍生物组。荧光素钠、虎红、丽丝胺绿B的分子式、分子量、颜色索引号见表1。结构式见图1。

　　二、荧光素钠的临床应用

　　荧光素钠(fiuoresciensodium)自1882年发现并用于角膜染色已有一百多年的历史。其水溶液在中性及碱性条件下具有鲜艳的绿色和强的荧光，酸性条件下荧光消失。通常将荧光素钠配制成水溶液作为染色剂。荧光素钠对健康角膜上皮细胞不染色，染色损伤的角膜是通过受损细胞间隙弥散渗入基质中所致。当细胞间连接破坏时，荧光素钠能迅速弥散渗入细胞间隙中，因此它适于测量角膜上皮细胞及内皮细胞的完整性，以及用于评估角膜上皮细胞的治愈情况。当某种药物破坏上皮细胞紧密连接时，用荧光素钠染色可评估对上皮细胞的毒性作用。由于荧光素钠在基质中迅速弥散，干扰了对细胞染色还是细胞间隙染色的辨别，所以它不是理想的结膜染色剂。荧光素钠的主要优点是耐受性良好，对眼无刺激性，且具有极好水溶性：临床常用形式为1%溶液或浸有荧光素钠的试纸条(1～1.5mg/条)。

　　近来研究显示，荧光素钠对几种培养的健康细胞也能染色，但需通过荧光显微镜观察，染色强度随着细胞的衰变或死亡而增强，这是由于衰变或死亡细胞的细胞膜发生变化，使得荧光素钠易于渗入。

　　在培养的兔角膜上皮细胞及正常兔角膜中证明，荧光素钠无细胞毒性。荧光素钠并不固定泪液中的蛋白、黏液、多糖类等成分，泪膜中含有蛋白、脂质、多糖，因此用荧光素钠可检测泪膜稳定性。利用其良好的水溶性，来测量角膜上皮和内皮的渗透性及检测房水的流动和渗漏情况。

　　荧光素钠染色在眼科临床上主要用于以下几方面：

　　(1)评估泪膜状态：用荧光素钠染色泪膜是评估泪膜状态的有效方法，泪膜不稳定，泪膜破裂时间(tear break-up time，TBUT)缩短是黏液缺乏性干眼症的体征。临床上泪膜在两次眨眼之间保持稳定和完整的时间长短，因人、因时而异，TBUT少于10秒表示泪膜不稳定。但TBUT结果的重复性较差，不建议单纯用TBUT诊断干眼症，主张用虎红或丽丝绿染色及Schirmer试验联合TBUT试验诊断干眼症。

　　(2)评估泪液分泌量、清除率以及泪道功能：通过荧光素钠染料清除率试验评估泪液的分泌和排泄情况。在结膜囊内滴加标准量的荧光素钠，它在泪液中的浓度每隔10分钟通过Schirmer试验的试纸条进行收集，与标准液对比，来评估泪液的分泌情况，荧光分光光度测定法是测量泪液分泌、泪液体积、泪液周转率的另一方法，但由于技术复杂、缺乏标准、设备昂贵而不易在临床上应用。Jones的泪道阻塞试验是在结膜囊内滴荧光素钠，观察其在鼻腔内出现的情况，用以判断泪道是否通畅。

　　(3)评估角膜接触镜符合性：配戴角膜接触镜之前，需在角膜上滴荧光素钠溶液，观察是否有角膜损伤，是否适宜配戴角膜接触镜。配戴片刻后取下接触镜。通过裂隙灯钻蓝片观察角膜，在接触镜接触角膜的地方是否染色，检查角膜接触镜是否合适。荧光素钠也用于角膜接触镜配戴者的跟踪检查，一旦发现有角膜上皮细胞损伤，应停戴，进行适当治疗。

　　(4)辅助Goldmann压平眼压计测量眼压：检查前在结膜囊内滴入荧光素钠溶液，将裂隙灯上眼压计测压头对准角膜中央，慢慢推向角膜，直至将与角膜接触，然后在显微镜下用单眼观察，操纵调节杆使测压头与角膜接触，可看到两个绿色半环，稍许调整使两个半环上下左右位置形态对称，转动压力盘上的旋钮，使两个荧光半环的内缘重和，退回裂隙灯显微镜，读出转盘上的读数。一些研究者认为不用荧光素钠也可测量，但眼压读数偏低，且随着眼压升高这种误差变大，可导致误诊。

　　(5)在角膜手术过程中、青光眼手术后的应用：荧光素钠可用于评估角膜受损程度，也用于进行Seidel试验，通过观测荧光素钠在角膜上的流动情况，跟踪角膜裂口部位以及观测青光眼滤过手术后滤过泡的渗漏情况。

　　(6)用于测定角结膜上皮细胞的损伤：在结膜穹窿处滴荧光素钠溶液后检测角膜损伤如擦伤、溃疡、水肿情况等。角膜上皮损伤时通常在损伤部位荧光素钠弥散地进入细胞并累积呈现鲜绿色，在裂隙灯下用钴蓝光片观察可见上皮损伤部位。

　　三、虎红的临床应用

　　荧光素钠是首要的角膜染色活体染料，虎红(rose bengal)则是首要的结膜染色活体染料。虎红为荧光素钠的衍生物(四氯四碘荧光素钠)，其水溶液呈玫瑰色，又称为玫瑰红或孟加拉玫红。1914年首次报告虎红用于眼表疾病诊断，但直到1933年Sjogren报告了虎红染色用于干燥性角结膜炎(KCS)患者后，才被广泛用于眼科领域。20世纪60、70年代Norn的一些研究显示，虎红只染死亡或衰变的细胞，对健康的上皮细胞不着色，原因是

　　死亡及衰变细胞膜受到破坏而被虎红染色，染色强度随着使用剂量的增加而增大。研究表明，虎红染色与结膜上皮表面的多糖被破坏有关，因此被染色的细胞不一定是死亡细胞或变性细胞，但一定有跨膜黏蛋白损伤。Feenstra和Tsengk报告，虎红稀释液可染色健康的兔角膜上皮细胞，达到一定浓度的染色剂能固定黏蛋白、羧基纤维素等成分。因此虎红可染色缺乏泪膜保护的上皮细胞，而不是缺乏活性的细胞，如KCS、Sjogren综合征，它们是由初期泪液缺乏继而导致眼表上皮细胞的变化。此外，上皮细胞发育不良、树枝状角膜溃疡或其它的上皮细胞炎症等均可干扰上皮细胞的正常黏液层，因此能被虎红染色。

　　有人认为虎红并不是真正意义上的活体染料。有研究表明，虎红在兔及人角膜上皮细胞培养中，显示出对细胞的毒性作用，这种作用与浓度有关。已注意到虎红对微生物如细菌、病毒具有毒性，可杀死细菌、病毒等微生物。因此在虎红染色前建议进行病毒培养，避免误诊由病毒引起的眼表疾病。

　　泪液缺乏可导致眼表上皮细胞的进一步变化，此时虎红眼表染色，角结膜暴露部分呈点状着染。临床上用0.5％或1.0％虎红溶液染色检测和评估KCS、角膜上皮树枝状溃疡、点状角膜炎、睑板腺功能障碍、暴露性角膜炎等”。虎红染色也可用于确定角结膜赘生物的程度，有利于完全切除，以减少术后复发。虎红的角膜缘及结膜染色举例见图2、3。

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