【摘要】 目的：研究LDLR基因和HMGCoAR基因在翼状胬肉组织中的表达。方法：随机选取原发性和复发性翼状胬肉组织各10例，正常结膜组织10眼。实时荧光定量PCR技术分析结膜中HMGCoAR和LDLR的相对mRNA含量。
结果：原发性和复发性翼状胬肉中的HMGCoAR及LDLR的mRNA水平均明显高于正常球结膜组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：HMGCoAR和LDLR基因可能参与翼状胬肉的发病过程。关键词：翼状胬肉；低密度脂蛋白受体；羟甲基戊二酰辅酶A还原酶；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应；基因表达
【关键词】 人翼状胬肉组织HMGCoA还原酶 LDL受体基因
Expression of lowdensity lipoprotein receptors and hydroxy methylglutarylcoenzyme Areductase in human pterygium
Qian Yu, Lin Liu, YongZhi Wang
1 Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital, Chengdu Medical College, Chengdu 610050, Sichuan Province, China;
2 Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;
3Staff Room of Microorganism, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
AbstractAIM: To quantitatively detect gene expression level of lowdensity lipoprotein receptors (LDLR) and hydroxy methylglutarylcoenzyme Areductase (HMGCoAR) in human primary pterygium, reccurent pterygium and conjunctiva. METHODS: Primary pterygium, recurrent pterygium and normal conjunctiva samples were obtained from 30 eyes at the time of surgery during February 2007 to February 2008. Quantitative realtime PCR was used to analyze the content of HMGCoAR and LDLR gene in pterygium and normal tissue. RESULTS: QRTPCR revealed a statistically significant increase of LDLR mRNA levels: 4.1 fold in primary pterygia and 2.7 fold in recurrent pterygium, compared with the control normal conjunctiva. The differences had statistical significance (P<0.05). Also the mRNA levels of HMGCoAR were increased significantly in both primary and recurrent pterygia by 4.2 fold and 3.6 fold respectively, compared with normal conjunctiva, with statistical significance (P<0.05). CONCLUSION: This study indicates that pterygium have an altered metabolism of cholesterol namely increased LDLR and HMGCoAR mRNAs, which is characteristic of tumorlike tissues. Both genes may play important roles in the pathogenesis of pterygium.
KEYWORDS: pterygium; lowdensity lipoprotein receptors; hydroxy methylglutaryl coenzyme Areductase; QRTPCR; gene expression
0引言
翼状胬肉是常见的眼表疾病，局部球结膜纤维血管组织呈三角形增生并侵犯角膜，其发生发展是多因素协同作用的结果，确切机制至今尚不清楚。研究其发生、发展的机制对预防和治疗这一疾病具有重要的临床意义。目前越来越多的证据表明翼状胬肉是良性肿瘤样组织，细胞高速生长导致胆固醇代谢调节紊乱。我们定量检测在胆固醇代谢中LDLR和HMGCoAR基因，了解在翼状胬肉中表达的情况。
1材料和方法
1.1材料
200702/200802我院手术的原发性翼状胬肉10例，复发性翼状胬肉10例。年龄55～70(平均63)岁，男12例，女8例，均为单眼发病。排除其它角、结膜的疾病，术前检查血脂、肝肾功均正常。正常结膜组织10例取自视网膜脱离手术中，所有对照组标本均无感染的征象。根据HMGCoAR和LDLR的mRNA基因序列，用Primer Premier 5.0引物设计软件设计2对引物（表1）。表1 PCR引物及产物大小（略）
1.2方法
在无菌条件下获得手术中翼状胬肉及正常球结膜组织,取材后迅速放入液氮中,按照Invitrogen公司 Total RNA Isolation System方法提取总RNA, 紫外分光光度仪测定其纯度和含量，10g/L琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。为了消除基因组DNA的污染，将总RNA用RNasefree DNase I (TaKaRa)处理，20μL的体系包括总RNA 1μg，10×buffer 2μL，RNasefree DNase I 4 U和RNA酶抑制剂8 U，37℃ 25min去除DNA，75℃ 10min使酶失活。LDLR，HMGCoAR和内参的引物序列均根据cDNA编码区设计。总RNA 500 ng利用MMLV反转录酶和随机 primer（Takara公司）合成第一链cDNA。β actin，LDLR和HMGCoAR的PCR产物10g/L琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收（EZNA Gel Extraction Kit），用于标准品的制备。测得A 260，计算各标准品cDNA浓度，稀释缓冲液等梯度稀释标准品，共设置10个浓度梯度： 101，102，103，104，105，106， 107，108，109，1010。从中选取4个梯度作为标准曲线。Realtime PCR根据Quanti Tect SYBR Green PCR试剂盒 (BioRad)手册进行。反应混合液20μL体系：SYBR Green mixture 10μL，上游Primer（10μmol/L）和下游Primer（10μmol/L）各0.5μL，模板 2.0μL以及ddH2O 7μL。基因扩增条件： 95℃变性60s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共40个循环。每次PCR扩增都要采用没有模板的阴性对照。通过顺序检测系统观察各扩增曲线、融解曲线，标准曲线的线形回归系数R值，统计软件自动进行样本的mRNA拷贝数的计算。以β actin的拷贝数对LDLR和HMGCoAR进行标化处理。
统计学分析：所有数据以均数±标准差(±s)表示，采用两样本均数t检验，P＜0.05为有显著性差异。
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