【摘要】目的：探讨准分子激光双面式切削原位角膜磨镶术(bothsided LASIK, BSL)的角膜创口愈合过程。方法：24只新西兰大白兔右眼按3.00D行LASIK，左眼角膜瓣上基质和基质床上分别按1.50D行BSL，分别于术后1,7d;1,3mo随机选取6只动物，行裂隙灯、活体共焦显微镜、组织病理学及透射电镜检查。结果：BSL术后角膜中央区透明，没有雾状浑浊（haze），早期角膜瓣边缘上皮增厚，变厚的上皮下角膜基质轻度不规则，随时间逐渐趋于正常。术后各时间均未见炎性细胞浸润。活体共焦显微镜下：BSL术后角膜瓣层间出现散在高反光颗粒，早期部分基质细胞激活， BSL组与LASIK组比较上皮基底细胞、创面后基质细胞、反光颗粒、激活细胞、神经纤维及内皮细胞数量与术后同时期比较均无显著性差异（P＞0.05）。透射电镜下：BSL术后早期上皮细胞轻微变性，少量纤维细胞核染色质边集，角膜瓣边缘局部胶原排列稍紊乱。1mo时基质胶原纤维排列整齐，直径大小一致。角膜各细胞的超微结构改变程度、角膜愈合的组织病理学变化与普通LASIK术后相似。结论：准分子激光双面式切削原位角膜磨镶术后角膜生物组织反应轻微，角膜愈合反应程度与普通LASIK术后相似，同时为最大限度的保留角膜基质床的剩余厚度创造了条件，是治疗近视的一种好的选择。
【关键词】 准分子激光;角膜磨镶术;激光原位;伤口愈合;动物实验;近视
Basic study of bothsided LASIK for myopia
WeiLi Li,Yuan Shen
Department of Ophthalmology, Hunan Want Want Hospital, Changsha 410016, Hunan Province, China
Correspondence to: WeiLi Li. Department of Ophthalmology, Hunan Want Want Hospital, Changsha 410016, Hunan Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To investigate the corneal wound healing process of bothsided LASIK on rabbitsMETHODS: Twentyfour adult New Zealand white rabbits were chosen as animal model. LASIK were performed on the right eyes to attempt a correction of 3.00D and bothsided LASIK were performed on the left eyes to attempt a correction of 3.00D also. All the rabbits were examined with slitlamp microscope and in vivo confocal microscopy before surgery and at 1 day, 1 week, 1 and 3 months after surgery. At each time of post operation examination, 6 operated rabbits were killed randomly, and all the corneas were removed for histopathological observation of transmission electron microscopy and light microscopy. RESULTS: Slitlamp microscopy examination: After bothsided LASIK, the cornea central region was transparency and had no haze. At early stage, epithelium thickened at the edge of the flaps and corneal stroma was slightly irregular, which tended to normal with the time. There was no inflammatory cell infiltration at each time. Confocal microscopy examination: postoperatively, highly reflective particles appeared in layers of flaps and a part of stromal cells were activated. Compared with LASIK, there were no significant difference on the number of epithelium stromal cells, activated cells, fibroblast cells and endothelial cells after bothsided LASIK (P>0.05). Transmission electron microscopy examination: epithelium cells degeneration, chromatin margination and collagen arrangement disorder could be observed at early stage after bothsided LASIK. One month later, collagen arrangement became order and had same diameter. Ultrastructure and histopathology changes were similar with LASIK.CONCLUSION: In bothsided LASIK, the corneal wound healing response is slight and is similar with LASIK. It creates the condition for preserving thickness of cornea stroma after surgery and is a good way to myopia treatment.
KEYWORDS: excimer laser; keratomileusis, laser in situ;
wound healing; animal laboratory; myopia
0引言
准分子激光原位角膜磨镶术（LASIK）因其术后视力恢复快，屈光状态稳定，被认为是目前最理想的矫正屈光不正的手术方式。但是对于近视度数较高，而角膜相对偏薄的患者，LASIK术后有可能出现角膜膨隆。可能的诱发因素有许多，但其中最为重要的是切削后剩余的瓣下角膜基质床的厚度[19]。改良的双面式LASIK（bothsided LASIK，BSL）应用双面切削方式，可以将部分屈光度放在瓣膜面上完成，通过我们的临床研究证实该种术式可为高度近视的患者提供较好的术后视力以及更高的安全性[10]。但该种术式是否会影响到角膜瓣的愈合，在国内外尚未见相关实验报道，本研究通过动物实验观察BSL与普通LASIK术后的角膜创口愈合过程，比较两种术后的角膜愈合过程之间是否存在差异性。
1材料和方法
1.1材料
健康新西兰大白兔24只，体质量2.3~2.5kg，雌雄兼用。全部实验动物裂隙灯和眼底检查无异常。将每只兔的右眼（预期LASIK矫正3.00D）作为LASIK组，左眼（预期BSL矫正3.00D）作为BSL组。
1.2方法
1.2.1 手术方法
250g/L乌来糖(2mL/kg)耳缘静脉注入麻醉后，常规消毒开睑。右眼作直径约为8.0mm带蒂的板层角膜瓣，蒂位于上方12点位，应用鹰视酷眼飞点扫描准分子激光系统，按预期矫正度数为3.00D，在基质床面进行准分子激光切削。左眼在3、6、9点近角膜缘处及角膜中央用龙胆紫记号笔作4处定位标记，做与右眼相同的板层角膜瓣，第1步，翻转角膜瓣，将角膜瓣上皮面平整贴附于自制角膜支撑器上，将预先所作4处定位标记与激光器上的“十”字形标记完全重合，以角膜中央标记点作为扫描中心，对角膜瓣基质面按预期矫正度数为1.50D进行激光切削。第2步，将瞄准中心移至瞳孔中心对基质床进行预期矫正度数为1.50D的激光切削。双眼激光切削后均立即复位角膜瓣，术毕，双眼滴入典必舒眼液，用胶布将术眼上下睑粘合，待苏醒后送回动物室。
1.2.2术后处理
术后第1d起，双眼均开始滴用典必舒眼液，4次/d，共4wk。分别于术后1,7d;1,3mo随机选取6只实验动物，耳缘静脉注入空气处死后立即摘除双眼眼球，沿角巩膜缘剪下角膜，将其分为两部分，一半浸入100g/L甲醛用于常规组织学检查，另一半浸入40g/L戊二醛用于透射电镜检查。光镜标本制作：甲醛固定24h后，石蜡包埋、切片（厚度约4~5μm），石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水、常规苏木精伊红染色，光镜下观察。透射电镜标本制作：标本用40g/L戊二醛前固定2h后，0。1 MPBS漂洗，10g/L锇酸后固定1h，0.1 MPBS再次漂洗，丙酮逐级脱水，Epon 812环氧树脂与1000g/L丙酮1∶1比例浸泡，Epon 812环氧树脂浸泡、包埋，超薄切片机切片，醋酸铀、硝酸铅双重染色，透射电镜观察。
1.2.3观察指标
(1)裂隙灯检查：分别于术后1,7d;1,3mo裂隙灯观察角膜形态，并行眼前节照相。(2)角膜共焦生物显微镜观察：海德堡角膜共焦生物显微镜分别于术前、术后1,7d;1,3mo观察角膜各层细胞的形态、大小、亮度，角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞数目，并对其进行手工计数。(3)组织病理学观察：分别取术后1,7d;1,3mo的HE标本，在光学显微镜下观察角膜创口愈合情况。(4)透射电镜观察：分别取术后1,7d;1,3mo的标本在透射电镜下观察角膜超微结构变化。
统计学处理：所有统计数据使用SPSS 13.0软件包计算，对计数资料采用χ2检验，对计量资料采用t检验。
2结果
2.1裂隙灯检查结果
两组术后角膜均无严重并发症，中央区透明，没有雾状浑浊（haze），角膜瓣贴附紧密(图1AD)。术后角膜瓣边缘可见环形均质浑浊，局限于边缘，无明显进展。
2.2角膜共焦生物显微镜检查结果
BSL术后可观察到角膜瓣微皱褶（图2A）及层间散在高反光颗粒，后者随时间减少(图2BE)，差别有显著性（P＜0.05）。我们将颗粒层界定为手术界面，在此界面上、下部分基质细胞核呈现高反光性、卵圆形并伴高反光的细胞外基质，与正常角膜细胞的多角形及较暗的细胞外基质有明显差异，称之为“激活细胞”(图2F)。激活细胞数量随时间减少，差别有显著性（P＜0.05）。术后第1d，BSL组创面前、后基质细胞数目比术前减少，差别有显著性（P＜0.05）。术后7d开始恢复正常（P＞0.05）。上皮基底细胞和内皮细胞数目在BSL术后各时期与术前比较，差别均无显著性（P＞0.05）。BSL组与LASIK组术前角膜各层细胞数量无显著性差异（P＞0.05），也未见形态学差异。术后两组比较发现：术后第1d，BSL组创面前基质细胞数量比LASIK组少，差别有显著性（P＜0.05），随后的时间点未观察到此种差异。BSL组激活前界面比LASIK组更靠近角膜上皮细胞。而两组上皮基底细胞、反光颗粒、激活细胞、创面后基质细胞及内皮细胞数量在术后各时期均无显著性差异（P＞0.05,表1）。表1两组术前、术后角膜各种细胞密度比较（略)
2.3组织病理学检查结果
BSL组术后第1d，手术区角膜上皮细胞无增殖，排列较为整齐，基底膜完整，组织中未见炎性细胞浸润。术后7d，角膜瓣边缘上皮细胞增厚至8~10层，变厚的上皮基底细胞呈圆柱状，比临近未损伤区域的角膜上皮基底细胞大，排列呈轻度不规则；变厚的上皮细胞向角膜瓣中央区逐渐变为正常（图3A,C）；角膜瓣边缘有上皮折叠植入生长的情况。术后1mo，切削区边缘变厚的上皮下角膜细胞基质不规则，而在中央区域，角膜基质排列基本规则，残留的角膜基质和角膜内皮无明显异常（图3B,D,E）。术后3mo，角膜上皮接近术前，角膜瓣与切削面贴附紧密，缝隙消失，隐约可见交界面的痕迹，胶原排列已接近正常（图3F）。LASIK组术后角膜上皮同样在早期增厚，随着时间变化，在1mo时达到高峰，3mo时厚度趋向正常；角膜瓣边缘亦有上皮折叠植入生长的情况。BSL术后各时期角膜愈合的组织病理学变化与同时期LASIK术后比较，无明显差异。
2.4透射电镜检查结果 BSL术后1d，手术区域角膜上皮细胞排列规则，基底膜完整，可见上皮细胞胞浆内部分粗面内质网轻度扩张(图4A)及上皮下纤维轻微变性（图4B），少量纤维细胞核染色质边集（图4C）；术后7d，角膜基质层间见一纤细疏松的纤维带（图4D）；术后1mo时，基质胶原纤维排列整齐，直径大小一致，间隔相同，在边缘局部观察到排列紊乱（图4E）；术后3mo时角膜胶原纤维排列整齐，纤维细胞未见明显改变（图4F）。两种术后各时期内皮细胞均无明显改变，角膜上皮细胞、上皮基底膜、基质内胶原纤维和成纤维细胞的超微结构改变程度相似，整个过程中未见炎性细胞浸润。
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