|
1对象和方法
1.1对象 患者来源于1999/2005宁夏医学院附属医院眼科就诊具有常染色体显性遗传特点的6个ADRP家系共47例成员（其中RP患者20例）。同时收集50例无血缘关系的健康成年人作为对照，以确定所检测到的变异是否系基因的多态现象。所有患者经过详细的家系调查及直接检眼镜、视野和视网膜电图检查，结果示均有典型的视网膜色素变性的症状和体征[7]。所有正常人经全面眼科检查均无眼科疾病。
1.2方法 收集所有研究对象的外周血标本加EDTA抗凝，采用DNA分离试剂盒从白细胞中提取全基因组DNA，干燥回收的DNA用1mL TE缓冲液溶解，80℃保存备用。运用primer 5.0软件对研究的RP1基因序列 (Genbank accession AH008047)进行引物设计，引物序列为5’GTCTACCCGCAAATCTCA3’,5’ACATCCAGCAAGTCCTCA3’，在其引物序列上进行PCR扩增。聚合酶链反应(PCR)的反应体系为：10×buffer（含MgCl210mmol/L）5μL,上游引物（10pmol/μL）1.0μL，下游引物（10pmol/μL）1.0μL,dNTP (2mmol/L) 1uL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL,DNA模板(70ng/μL) 5μL, 加超纯水至50μL。 PCR反应条件: 95℃预变性5min ,94℃变性 45s, 56.5℃退火 40s,72℃延伸 40s,35个循环。后延伸72℃ 7min,PCR反应均在美国的BIORAD和ABI仪器上进行，反应试剂均购自于北京赛百盛公司。PCR反应结束后，将反应产物进行15g/L琼脂糖电泳，同时加Maker标记DNA相对分子量，透射紫外线观察DNA电泳带凝胶成像仪照相，计算机分析结果。对扩增出的PCR扩增产物经纯化试剂盒纯化后直接测序。运用美国PE（PerkinElmer）公司3.0版本的序列分析软件进行DNA序列分析，对出现杂合波的样本，为清楚显示DNA片段中的每一个碱基，序列分析有时从正反两个方向重复进行。对照已发表的RP1基因序列资料（GenBank识别号为AF143222），用Sequence Navigator软件分析单核苷酸多态性(SNP)的位置及类型。
统计学处理：全部分析过程在SPSS 11.0统计软件上完成，P﹤0.05为差异有统计学意义。所有基因型设为分类变量（纯合子:2，杂合子:1,野生型:0）。采用χ2检验对每一检测到的突变位点是否符合HardyWeinberg平衡进行分析，采用多因素Logistic回归进一步分析RP1基因各突变位点与RP发生的相关性。
2结果
2.1 DNA直接测序结果 在RP1基因的第4外显子上共检测出2个变异位点，（表1）其密码子分别为1691和1725。经χ2检验得出所检测到的变异位点均符合HardyWeinberg平衡。参照国际ADRP最新的突变位点数据库[5]，1691(SerPro, TCT→CCT)及1725（GlnGln，CAA→CAG）位点已被证实为基因多态性(single nucleotide polymophism,SNP)。将所有患者的测序波形和正常波形对照,1691密码子：6个ADRP家系中发现有40例成员（RP患者16例），其第1个碱基由T变成C，引起编码氨基酸的改变，由丝氨酸突变为脯氨酸（Ser→Pro）。在对照组中发现该位点的变异27例。A,B,C分别为正常序列，杂合突变，纯合突变的测序结果（图1） 。1725密码子：第3个碱基由A变成G，但未引起编码氨基酸（脯氨酸）的改变(图2)。
图1 1691密码子 A:RP1基因第4外显子1691密码子邻近正常基因序列;B:RP1基因第4外显子杂合突变序列，第1691密码子出现T→C杂合波，异常碱基波(蓝色)出现在正常碱基波(红色)的位置;C:RP1基因第4外显子纯合突变序列，第1691密码子出现T→C碱基置换，异常碱基波(蓝色)出现在正常碱基波(红色)的位置（略）
图2 1725密码子 A:RP1基因第4外显子1725密码子邻近正常基因序列；B:RP1基因第4外显子杂合突变序列，第1725密码子出现A→G杂合波，异常碱基波(黑色)出现在正常碱基波(绿色)的位置；C:RP1基因第4外显子纯合突变序列，第1725密码子出现A→G碱基置换，异常碱基波(黑色)出现在正常碱基波(绿)的位置 （注：图1，2均为彩色转黑白图片）（略）
2.2 家系对照分析 6个ADRP家系成员（47例）中有40例直接测序结果显示RP1基因第4外显子的1691密码子，其第1个碱基由T变成C，引起编码氨基酸的改变（Ser→Pro）。其40个成员中该位点呈C纯合子的11例，29例呈杂合子状态（表1）。在对照组中发现6例该位点的纯合状态，21例杂合子状态。1725密码子40例第3个碱基由A变成G，但未引起编码氨基酸的改变（Gln→Gln）。
表1 RP1基因各突变位点基因型和等位基因在RP家系和对照人群中的分布（略）
注：野生型/杂合子/纯合子，百分数为各基因位点在相应组里的突变率
对照组结果与1691密码子相同。 经χ2检验，家系成员在S1691P和Q1725Q位点的突变率显著高于正常对照组(P<0.05 )。用多因素Logistic回归方法进一步分析各突变位点与RP的发生的相关性，发现RP1基因的S1691P与Q1725Q位点的变异与RP的发生呈显著相关（P=0.003）。
上一页 [1] [2] [3] 下一页 |
