【摘要】 目的 检测神经细胞黏附分子(NCAM)在成年大鼠不同视神经再生模型中的表达，探讨NCAM分布情况与其在视神经再生中的作用。方法 选择64只健康成年雄性SD大鼠，随机分成2组，自体视神经—坐骨神经吻合模型32只为实验组，自体视神经—视神经吻合模型32只作对照组。于吻合术后15天、30天、45天、60天处死动物并取出吻合段神经。利用免疫组织化学方法(SP法)和计算机图像分析技术，测定NCAM在不同吻合模型中的表达。结果 NCAM在视神经—坐骨神经吻合模型表达水平高于视神经—视神经吻合模型。吻合术后早期表达水平明显高于末期。结论 坐骨神经移植有助于增加NCAM表达，促进视神经再生。
【关键词】 神经细胞黏附分子；视神经再生；坐骨神经；免疫组织化学
Expression of NCAM in the optic nerve regeneration model of the adult rats
ZHU Yi-hua,ZHU Jie,TANG Bao-feng,et al.
Ophthalmology Department,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of NCAM in the optic nerve regeneration model of the adult rats.Methods 64 SD rats were randomly divided into two groups.The right optic nerve of all rats were transected.In the experiment group,an autologuous sciatic nerve of 15mm segment in the right was anastomosed to the distal optic nerve stump.In the control group,the cut ends of optic nerve were reapproximated by sutures.Animals were allowed to survive for 15,30,45 and 60days.The anastomosed nerves were taken from them and determined the expression of NCAM by immunohistochemistry.The immunohistochemistry stainings were analyzed by automatic image analysis technology.Results The expression of NCAM in the experiment group were significantly higher than in the control group.Conclusion NCAM could play an important role in the regeneration of the optic nerve.A sciatic nerve graft onto the transected optic nerve help to induce the regeneration in adult rats.
【Key words】 NCAM；optic nerve regeneration; sciatic nerve;immunohistochemistry
近年神经生物学研究显示：视神经具有再生潜能，只是局部的微环境影响它的再生。坐骨神经的成功再生有赖于一个适宜的微环境，因而将坐骨神经移植到受损的视神经，改变视神经微环境，有可能促进视神经再生。神经细胞黏附分子(NCAM)在神经再生中的重要作用越来越受到关注。本课题就NCAM在成年大鼠自体视神经—坐骨神经吻合模型和视神经—视神经吻合模型术后不同时期的表达进行研究，探讨NCAM在视神经修复和再生中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性Sprague-Dauley大鼠150～200g，共64只(由福建医科大学实验动物中心提供)，随机分成2组，自体视神经—坐骨神经吻合模型组32只作实验组，自体视神经—视神经吻合模型组32只作对照组。按吻合术后15天、30天、45天、60天分别将各组随机分入4个时间点。每个时间点实验组及对照组各8只。
1.2 动物模型的建立
1.2.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 大鼠用氯胺酮10mg/kg腹腔麻醉，眼科手术显微镜下，经右侧眶上缘切口钝性分离至球后、暴露视神经，距眼球壁后4mm切断视神经，将取自体右下肢长约15mm的坐骨神经近中端与视神经远中残端行端-端吻合，并在吻合处以硅胶套管，坐骨神经另一端固定于头皮下。最后缝合切口。
1.2.2 自体视神经—视神经吻合模型 动物依上法暴露右眼视神经，距眼球壁4mm切断视神经，将两断端行端-端吻合。距此吻合处4mm切断视神经，将此断端固定于头皮下，最后缝合切口。
1.3 标本的取材、固定、制作 于吻合术后15天、30天、45天、60天各处死实验组及对照组大鼠各8只。取吻合段神经标本长约5mm。经10%中性福尔马林固定，常规脱蜡，石蜡包埋，作4μm厚石蜡切片。
1.4 HE染色 石蜡切片烤片过夜，常规脱蜡，苏木精染色，盐酸酒精分色，伊红染色，常规脱水后中性树胶封固。
1.5 免疫组织化学SP法 石蜡切片，使用SP-超敏试剂盒(福建迈新公司)染色。第一抗体NCAM Ab-1(1∶100)为美国NEOMARKERS公司产品。AEC显色，苏木精对比染色，水性封固。切片在相同一条件下进行。以PBS代替一抗作阴性对照；以大脑阳性片作阳性对照。
1.6 图像分析 光镜下，依着色强度分为强阳性、阳性、弱阳性、极弱阳性和阴性。标本经Video Pro32彩色图像分析系统(澳大利亚Leading Edge Pty Ltd)处理：每组取8张不同样本切片，置于物镜(×40)下，每张切片取3个视野，通过彩色图像分析系统，分别测量平均光密度值(OD)。
1.7 统计学方法 对所得的数据进行统计处理，用均数±标准差(±s)表示。比较NCAM在大鼠坐骨神经及视神经的表达平均光密度值，采用独立样本比较t检验，不同发育时间OD值比较采用方差分析、Post Hoc t检验，以P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察
2.1.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 在取材的过程中可见视神经与坐骨神经断端连接良好，吻合处光滑，未见神经瘤样膨大，并且有完整且连续的神经外膜，两条神经已成为一体、视神经端明显增粗、管径与坐骨端大小基本相同。周围有轻度纤维组织粘连及血管增生。
2.1.2 自体视神经—视神经吻合模型 吻合术后15天可观察到，视神经两断端外膜已连接，吻合处未见神经瘤。视神经有萎缩，管径变细。周围有轻度纤维组织粘连及血管增生。
2.2 HE染色结果
2.2.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 15天组可见神经轴突变性较明显，大部分崩解，呈网状分层、形成较大的空泡。淋巴细胞浸润，30天组可见神经变性仍明显，空泡可见，少许视神经纤维增生，淋巴细胞浸润明显。45天组及60天组神经变性较轻，空泡明显减少，视神经纤维大量增生。
2.2.2 自体视神经—视神经吻合模型 15天组视神经溃变，纤维变细小，部分断裂、不连续。较多淋巴细胞浸润。30天及45天视神经溃变明显，纤维断裂，未见明显的纤维增生。60天组视神经溃变较重，大部分纤维断裂、崩解成空泡或网状，未见有明显的纤维增生。
2.3 NCAM免疫组织化学染色结果
2.3.1 在视神经—坐骨神经吻合模型表达 在吻合术后4个不同时间组，均可见分布。表现为红色至浅红色，不规则的线状。随着术后时间增加，反应强度逐渐减弱。其中术后15天组表达相对较强，着色最深，表现为阳性、红色(见图1)。相对15天组，术后60天组反应较弱、着色较浅，表现为弱阳性、浅红色(见图2)。
2.3.2 视神经—视神经吻合模型表达 呈弱阳性—极弱阳性，表现为淡红色稀疏地散在于神经胶质细胞附近。术后15天组可见少量表达(见图3)，其余30天组、45天组、60天组表达不明显。
2.4 计算机图像分析 NCAM在视神经—坐骨神经吻合模型组(SON)和视神经—视神经吻合模型组(OON)表达的OD值，见表1。SON组表达水平明显高于OON组。
表1 NCAM在SON组和OON组表达的OD值 略
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