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2结果
2.1人晶状体ALDH1A1基因克隆和重组 从人晶状体的cDNA基因文库，使用ALDH1A1,ALDH2A1, ALDH3A1引物，仅ALDH1A1基因被扩增出来，为一条1.5kb的DNA带（图1），通过基因测序确定该基因为1506bp的ALDH1A1序列（图2）。重组的人晶状体ALDH1A1与人肝脏的ALDH1A1有100 % 的同源性(NM_000689) ,与黑猩猩有98% 的同源性(CR860845) , 与兔有91% 的同源性(AY038801),与牛(BC105193)，羊(NM_001009778)和猪(AK232310)有90%的同源性, 与大鼠(U79118)和小鼠(M74570)有85%的同源性。
2.2重组人晶状体ALDH1A1蛋白质及序列 通过蛋白质氨基酸的测序，表达的人晶状体ALDH1A1蛋白质为 501个氨基酸组成（图3, Genebank AY390731），而蛋白质电泳显示其分子质量为 54.8kDa(图4)， PI=6.8。 含有ALDH1A1基因的BL21DE3细胞株培养过程中加IPTG后，ALDH1A1蛋白质含量及活性逐渐增加，约12h达高峰，不同的诱导时间后ALDH1A1活性曲线见图5。
2.3重组人晶状体ALDH1A1的特点 重组人晶状体ALDH1A1在NAD作为辅酶时的活性明显高于NADP作为辅酶时，NAD的Km为55μmol/L，NADP作用很小几乎可以勿略不计（图6）。重组人晶状体ALDH1A1在100mmol/L sodium pyrophosphate 作为缓冲液的活性高于100mmol/L TrisHCl作为缓冲液时（P=0.01477）；并且在1mmol/L dTT 作为还原剂时的活性高于在10mmol/L βMercaptoethanol 作为还原剂时（P=0.000736）（图7）。重组人晶状体ALDH1A1在缓冲液中pH值由7增加到 9时其活性逐渐增加 (图8)；其活性在使用1mol/L的imidazole析出后迅速减低,而使用凝血酶切下的酶活性可维持较长的时间(图9), 特别是用300mL/L甘油保存在20℃或80℃时，其活性可维持数月以上。
图4 重组的人晶状体ALDH1A1蛋白质的考马氏染色和Western blot（略）
A：coomassie blue染色；B：ALDH1A1抗体的Western blot 1:SDSPAGE 蛋白质分子质量标准；2:IPTG诱导前；3:IPTG 诱导后；4:粗提物；5:纯化的ALDH1A1
图5 IPTG诱导下的ALDH1A1活性（略）
图6 辅酶NAD和NADP与重组人晶状体ALDH1A1活性（略）
图 7 反应缓冲液和还原剂与重组人晶状体ALDH1A1活性 aP<0.05 vs TrisHCl；bP<0.01 vs βMercaptoethanol（略）
图 8 pH与重组人晶状体ALDH1A1 活性（略）
图9 析出方法与重组人晶状体ALDH1A1活性（略）
3讨论
King[14]和Choudhary等[9]的研究表明ALDH1A1为人晶状体组织中的一种重要的同工酶。在此我们使用ALDH1A1,ALDH2A1和ALDH3A1引物，在人的晶状体基因文库中仅扩增出来ALDH1A1，再次表明ALDH1A1确实是人晶状体中的一种重要的同工酶。这是首次报道人的晶状体ALDH1A1被重组和构建，ALDH1A1基因和蛋白质序列已经被收录在基因文库 [15]。
重组的人晶状体ALDH1A1为1506bp和501氨基酸（图2，3）， 分子质量为54.8kDa，100% 与人肝脏的ALDH1A1的DNA和氨基酸序列相同 [16]。两者同源性可能意味着它们在组织中发挥同样的作用，即氧化醛为相应的酸而代谢去毒醛类。与其它种属的同源性比较：黑猩猩肾为98%,兔角膜为91%，牛视网膜和羊肝脏为90%,大鼠肝及小鼠肝分别为85%。Hsu等 [16]表明重组的肝 ALDH1A1为53kbp长，分为13个外显子编码501个氨基酸。Zheng等[17]报道表达的ALDH1A1为分子质量55kDa的亚单位，pI=5.4，特异活性为0.26kU/g，产量 为每升的细菌培养液产生大约3mg的ALDH蛋白质。 我们重组的人晶状体ALDH1A1在IPTG的诱导下也有好的产量和活性，500mL的E Coli细胞培养液有10～40mg的纯化ALDH1A1 蛋白质，活性为0.27kU/g 。由于1mol/L imidazole对ALDH1A1有毒性，其活性在析出后迅速失去，而且即使用缓冲液置换也不能恢复其活性，所以我们改凝血酶切去Histag，酶活性可以维持较长的时间（图 9），尤其是使用300mL/L的甘油保存在20℃～80℃时活性可维持数月以上。
ALDH1A1 酶活性特点分析表明重组的人晶状体ALDH1A1 在 NAD作为辅酶时的活性较NADP高（图6），NADP在酶活性反应中显示的作用很少几乎可以忽略不计，然而Wang等[18]报道在酵母ALDH1A1， NAD的Km为NADP的170倍从而提示ALDH1A1为NADP依赖的酶，这与我们的结果和其他的报道不同，我们的结果显示人晶状体ALDH1A1为NAD依赖的酶，说明不同种属酶的反应特性不一样。Ahvazi等[19]解释可能为不同酶的活性中心有特异的决定簇提供给NAD或NADP结合，例如，V Harveyi的NADP+特异的ALDH有2个带正电荷的氨基酸残基Lys172 和Arg210,以及一个中性的氨基酸残基Thr175, 这3个部位与辅酶的2磷酸盐组的氢键结合反应有关，而在NAD+特异的ALDH1A1，相同部位的氨基酸残基为Glu195。 我们的结果还表明ALDH1A1活性在1mmol/L dTT 为还原剂时较βMercaptoethanol为高，这可能为ALDH1A1含有较多的半胱氨酸，需要高活性的还原剂维持其活性，而dTT的还原活性要比βMercaptoethanol高；并且ALDH1A1 活性随着反应缓冲液的pH增加而增高(图 8 )，这说明ALDH1A1喜欢偏碱性的环境； ALDH酶活性在不同的反应缓冲液，如100mmol/L Sodium Pyrophosphate 反应缓冲液时的活性较0.1mol/L TrisHCl缓冲液时的活性高。上述的ALDH酶学特点为进一步进行人晶状体ALDH1A1酶动力学研究提供了基础。醛为ALDH1A1的常见底物，ALDH1A1NAD底物的反应过程可能为开始的NAD结合到ALDH1A1形成ALDH1A1NAD复合物，随后底物结合到ALDH1A1NAD复合物中，在疏水的活性部位形成半缩醛的中间产物，半缩醛的中间产物释放NAD上C4位的氢离子而分解成硫酯，该硫酯然后水解，释放COOH,最后还原为NADH，完成整个过程 [20]。此反应过程受各个环节，如缓冲液，辅酶，底物及pH的影响，由于ALDH1A1为人晶状体一种重要的同功酶，在代谢脂质过氧化产物醛类如HNE中起重要的作用，因而进一步研究如何维持ALDH活性，促进毒性的脂质过氧化醛类产物如HNE的代谢可能为白内障的防治研究提供另一条崭新的途径。
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