【摘要】 目的：探讨玻璃体内注射重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rHuEPO)对慢性高眼压所致的大鼠视网膜神经元损伤的保护作用及其可能的作用机制。方法：健康SD大鼠30只随机分为5组，每组6只，分别为损伤组I，损伤组II、DMSO组、rHuEPO组和rHuEPO+ Wortmannin(WM)组。各组均以右眼为实验眼，损伤组II大鼠激光处理1d后处死，其余各组激光处理8wk后处死。损伤组用532nm激光烧灼大鼠角巩膜缘浅层静脉，阻断房水回流的方法建立大鼠慢性高眼压模型，采用Tonopen眼压计测量眼压。DMSO组、rHuEPO组和rHuEPO+ WM组大鼠均在激光处理后1d开始分别向玻璃体内注射DMSO、rHuEPO和rHuEPO+ WM,1次/wk。正常对照组选取损伤组左眼作为对照眼。用免疫组织化学法和TUNEL染色检测观察各组实验结果。结果：与正常对照组比较，各组视网膜神经节细胞层(retinal ganglion cell layer,RGCL)中促红细胞生成素受体(erythropoirtin receptor,EPOR)表达增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组比较，各组RGCL中蛋白激酶B(AKT)表达无明显改变，差异无统计学意义，损伤组I和DMSO组RGCL中磷酸化蛋白激酶B(PAKT)表达也无明显改变，但rHuEPO组RGCL中PAKT表达增加(P<0.05)。与损伤组I和DMSO组比较，rHuEPO组RGCL中凋亡神经细胞数目减少(P<0.05)。与rHuEPO组比较，rHuEPO +WM组RGCL中AKT表达无明显变化,但PAKT表达减少(P<0.05)，凋亡神经细胞数目增加(P<0.05)。结论：rHuEPO对慢性高眼压所致的大鼠视网膜神经元损伤有保护作用，且rHuEPO通过PI3K/AKT信号途径抑制神经细胞凋亡而发挥其视神经保护作用。
【关键词】 促红细胞生成素 视网膜神经细胞 细胞凋亡 信号途径 神经保护
0引言
目前认为青光眼是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，视神经保护治疗已成为青光眼治疗的新内容，并已成为青光眼研究中的方向和热点问题[1]。随着促红细胞生成素受体(erythropoietin receptor, EPOR)表达在中枢神经系统和视网膜神经元中的发现和证实，促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)不再单纯是一个造血因子，而是作为一个新的神经营养因子备受关注。重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin, rHuEPO)在急性高眼压视网膜缺血再灌注损伤模型[2]和视神经切断损伤模型[3]中的神经保护作用已被证实，其可能的作用信号途径包括PI3K/AKT，ERK/MAPK，NFKB以及STAT5等[24]。
为探讨rHuEPO在慢性高眼压模型中的视神经保护作用及可能的作用机制，我们采用532nm激光烧灼SD大鼠角巩膜缘浅层静脉诱导慢性高眼压损伤视网膜神经元，探讨玻璃体内注射rHuEPO或联合注射rHuEPO+Wortmannin(WM)后，能否减少视网膜神经节细胞层(retinal ganglion cell layer, RGCL)中神经细胞凋亡数目，并比较各组RGCL中EPOR，AKT和PAKT表达的变化，以此阐明rHuEPO对慢性高眼压所致的RGCL神经元损伤的保护作用及可能的作用机制。
1材料和方法
1.1材料 由中南大学湘雅二医院动物实验中心提供健康雄性SD大鼠30只，体质量200～250g之间，经检查四肢和尾部无疾缺，颈软无歪斜，双侧眼球等大，眼睑完整，睫毛整齐，角膜透明，屈光间质清晰，眼底正常。实验仪器及试剂:倍频532nm激光仪(法国Quantel Mefical SL Viridis Twins)，Tonopen笔试眼压计(美国Medtronic)，眼科手术显微器材(苏州明仁医疗器械公司)，Leica XM2000R切片机(德国Leica公司)，普通光学显微镜Nikon Y100(日本Nikon)，计算机图像分析系统(北航医学图分析管理系统，CMIAS 2000型)，5μL微量进样器。益比奥3000U(沈阳三生制药股份有限公司)，Wortmannin(WM,上海康成生物)，兔抗大鼠EPOR多克隆抗体、羊抗大鼠AKT多克隆抗体、兔抗大鼠PAKT多克隆抗体(美国Santa Cruz公司，北京中杉生物工程公司分装)，TUNEL试剂盒(美国Promega公司)，SABC免疫组化试剂盒(北京中杉生物工程公司)。
图1 激光前后大鼠眼压随时间的改变（略）
1.2方法
1.2.1大鼠慢性高眼压视网膜神经元损伤模型的制作 水合氯醛100g/L(2mL/kg)ip深度麻醉大鼠，10g/L丁卡因滴眼液表面麻醉右眼，采用532nm激光烧灼角巩膜缘3/4周巩膜浅层静脉环及分支。激光参数：能量0.4W,曝光时间0.7s，光斑50μm。共计60～80激光点。模型制作前1wk每天上午9∶00测量大鼠眼压，激光处理1h;1,3d;1,2,4,8wk后上午9∶00测量大鼠眼压。在实验过程中如眼压下降至<30mmHg，则进行补充激光烧灼处理。
1.2.2玻璃体内注药 大鼠经ip 100g/L水合氯醛2mL/kg深度麻醉后，点10g/L丁卡因表面麻醉，用5μL微量进样器从角巩膜缘后进针，避开晶状体，斜向后进入玻璃体内注药：DMSO组1∶1000浓度的DMSO 1μL，rHuEPO组1μL 3000U/mL，rHuEPO+WM组0.75μL 4000U/mL+0.25μL 0.1mmol/L WM。用免疫组织化学法观察各组RGCL中EPOR, AKT, PAKT表达的变化。通过末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)检测RGCL中凋亡细胞的数目。用医学图像分析管理系统在400倍视野下，每张切片随机选取10个视野，对EPOR,AKT和PAKT免疫组织化学染色结果和TUNEL荧光进行分析，测量RGCL中EPOR,AKT和PAKT的平均光密度值，对TUNEL阳性细胞计数。
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