角膜结膜及泪器病             244                                      PO0182

　　TNF- 抑制培养的人角膜基质细胞缝隙连接

　　郝继龙  谷树严  张冰洁  周鸿雁  姜宏
　
　　吉林大学中日联谊医院眼科 130000

　　目的：研究TNF-调控角膜基质细胞间缝隙廉洁的机制。

　　方法：传代培养第5代的角膜基质细胞悬液 (3 x 105/)种植于4房底面为载波片的塑料培养板中 ，于含有10% FBS的MEM中培养3天后换成不含FBS 的MEM中培养1天，然后，换成含有TNF- 的MEM培养液培养6、12、24小时，应用特异性抗体通过免疫荧光和免疫印迹分析方法观察角膜基质细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达，通过细胞内显微注射观察细胞间荧光染料转染的dye coupling 方法测定角膜基质细胞间缝隙连接功能的活性。

　　结果：角膜基质细胞间存在功能的缝隙连接，TNF-α以剂量依赖关系抑制角膜基质细胞缝隙连接。Cx43于细胞间相互连接的细胞膜部位呈点状染色。免疫印迹分析结果显示角膜基质细胞未添加任何刺激，细胞裂解产物行免疫印迹分析，可检测到4个Cx43条带，分子量分别相当于43、47、48、49kDa；细胞裂解产物添加碱性磷酸酶，导致分子量为47、48、49kDa的条带减少，43kDa条带增加，但是碱性磷酸酶的作用能被Na3VO4所阻断，表明43kDa条带为非磷酸化Cx43[Cx43-NP]，47、48、49kDa条带分别为磷酸化Cx43[Cx43-P1 , Cx43-P2 , Cx43-P3]。添加TNF-α与角膜基质细胞共同培养，显著减少Cx43-P1 , Cx43-P2 , Cx43-P3 ，Cx43-NP并没有增加，表明TNF-α不仅影响Cx43的磷酸化，还影响Cx43量的表达。

　　结论：TNF-α通过抑制角膜基质细胞缝隙连接蛋白Cx43的磷酸化和Cx43量的表达而抑制角膜基质细胞缝隙连接功能。
　
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