角膜结膜及泪器病             1575                                      PO0268

　　TaqMan探针标记多重荧光PCR快速诊断真菌性角膜炎

　　袁进  陈家祺  陈志士 周世有 顾建军 孙明霞

　　广州中山眼科中心 510060

　　目的 探讨TaqMan探针标记多重荧光PCR技术快速诊断真菌性角膜炎致病菌属的价值。  

　　方法  选择真菌rDNA 基因的ITS2区域为分子鉴定靶区域，针对曲霉菌属、镰孢菌属和念珠球菌属分别设计三条特异性的Taqman探针。在ITS上游的5.8S rDNA保守序列中设计一条通用的正向引物，在探针的下游的ITS2区域内分别设计了三条特异性的反向引物。对烟曲霉、茄病镰孢菌、白色念珠球菌等15种标准真菌菌株和临床分离菌株进行多重PCR扩增。以绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌8种细菌，单纯疱疹病毒以及兔、眼库正常人角膜作为多重PCR扩增对照，分析TaqMan探针多重PCR检测真菌致病菌属的特异性和敏感性。采用临床菌株建立真菌角膜炎动物模型，分别采用角膜刮片TaqMan探针多重PCR扩增、以及真菌培养两种方法进行检测，比较真菌检出阳性率。 

　　结果  通过TaqMan探针多重PCR能同时特异性检测出三种致病真菌属的DNA，而作为对照的细菌、病毒及角膜组织均表达阴性。在烟曲霉、茄病镰孢孢子、白色念珠球菌CFU的浓度为102到107时，每个PCR反应中含有的孢子或者菌落数量的Log10 与荧光PCR的CT（荧光信号高于阈值的最小PCR循环数）具有良好的线性关系（R2 >0.9）。烟曲霉的最低检测浓度为9.6 个孢子/PCR反应，腐皮镰孢为6.4个孢子/PCR反应, 白色念珠球菌为3.6个孢子/PCR反应。从兔真菌角膜炎模型中采取角膜刮片TaqMan探针多重PCR检测的阳性率分别为，烟曲霉89.2％，镰孢测92.5％，白色念珠球菌98.6％，而各菌属采用真菌培养法检测的阳性率为40-50%。 

　　结论   TaqMan探针标记多重荧光PCR可对真菌性角膜炎进行快速检测，同时对致病菌属进行鉴定，具有较好的特异性和敏感性，在真菌性角膜炎的诊断和治疗中具有重要的应用价值。

　　声明:本站独家报道，转载须标明来源“中华眼科在线”