【摘要】 目的：研究TNFα对内皮细胞与周细胞PDGFB/PDGFRβ表达的作用。方法：常规剂量100 μg/L以及大剂量2450μg/L TNFα作用于培养的视网膜微血管内皮细胞、周细胞，通过免疫组化、Western Blot、RTPCR检测PDGFB/PDGFRβ表达。结果：内皮细胞组大剂量TNFα组，PDGFB表达显著下调，8h表达开始出现下调，在12h，PDGFB的表达量为原来的39％；在人视网膜微血管周细胞组，与对照组相比，常规TNFα剂量组PDGFRβ表达并未出现显著改变；大剂量TNFα组，与对照组相比，PDGFRβ表达在12h下调为45％。结论：TNFα可引起内皮细胞与周细胞PDGFB/PDGFRβ表达降低。
【关键词】 内皮细胞 周细胞 TNFα PDGFB PDGFRβ 增生
0引言
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DRP）是大多数发达国家工作年龄人群致盲的首要原因,是最常见的视网膜血管性疾病[1]。DRP的确切发病机制依然未明。1963年，Cogan等[2]发现，DRP组织病理学中具有特征性的早期改变是视网膜毛细血管周细胞的相对选择性丢失。对于早期周细胞特异性丢失，以往的结果认为可能是糖代谢改变引起毒性产物山梨醇、终末糖基化产物蓄积导致的[3，4]。为了进一步改进内皮细胞及周细胞培养方法，依据以往的文献，针对糖尿病视网膜病变早期的炎症这一关键变化，我们采用炎症因素TNFα为干预因素，研究其对视网膜微血管内皮细胞与周细胞PDGFB/PDGFRβ表达的影响。
1材料和方法
1.1材料 视网膜微血管内皮细胞和周细胞原代培养及传代培养详见文献[5，6]。TNFα处理组：常规剂量（100 μg/L）TNFα组、大剂量（2450μg/L）TNFα组。细胞处理：培养的细胞在暴露因素处理0，4，8，12，24，48h收集细胞及细胞爬片进行相应的检测。
1.2方法
1.2.1免疫组化 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2×107/L的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5d后进行免疫细胞组织化学染色鉴定，PBS清洗标本 3次，各2min，40g/L多聚甲醛固定15min，空气干燥 5min；PBS清洗标本3次，各2min；5mL/L Triton X100( DPBS配 )孵育 1次，20min，PBS清洗标本3次，各2min；30mL/L H2O2孵育15min；DPBS清洗标本3次，各2min；封闭血清孵育（50mL/L正常二抗血清DPBS液）20min；一抗孵育（PBS配，滴度1∶200，湿盒）4℃过夜或37℃，60min；PBS清洗标本 3次各5min；二抗工作液孵育（湿盒） 37℃，30min；PBS清洗标本 3次各 5min；C液（湿盒） 37℃，30min；PBS清洗标本 3次，各5min；DAB显色（避光，镜下观察至蓝色）约3～10min；蒸馏水洗2次，1min；自来水洗 30min；树胶封片。所有细胞的漂洗均采用0.01mol/L（pH7.4）PBS进行。同时染色设有PBS替代一抗的空白对照和正常羊血清（1∶50）替代一抗的替代对照。即阴性对照采用一抗来源血清，另一为PBS液阴性对照。
1.2.2免疫荧光染色ABC法 FITC,TX标记的荧光二抗孵育（PBS配，滴度1∶200，湿盒）4℃过夜或37℃，60min；PBS清洗标本 3次，各5min，封片，在共聚焦荧光显微镜下进行观察；所有细胞的漂洗均采用0.01mol/L（pH7.40）PBS进行。同时染色设有PBS替代一抗的空白对照和正常羊血清（1∶50）替代一抗的替代对照。即阴性对照采用一抗来源血清，另一为PBS液阴性对照组；每组随机选取15个细胞经图像分析仪测定，灰度值大，透光强，表示产物表达弱；反之，灰度值越小，表达强度愈高。
1.2.3 Western blot Western blot于各时间点收集细胞培养板，用预冷的0.01mol/L PBS冲洗2遍，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，120μL(/106～107)细胞，冰上放置振摇15min，用细胞刮将细胞刮下，移至冰上预冷的1.5mL离心管中，冰浴30min，4℃离心，10000r/min×10min，小心吸取上清至另一预冷的离心管中，20℃保存。采用BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司，美国）进行蛋白定量，取按一定倍数稀释的蛋白样品和标准品各10μL分别加至96孔板；每孔加入200μL工作液，混合，振荡30s；96孔板盖好盖子，37℃温浴30min；取出96孔板静置至室温；于酶标读数仪上测定570nm处吸光度值；将标准品的吸光度值（已用空白值校正）输入SPSS 10.0软件，绘制标准曲线；根据标准曲线，由蛋白样品的吸光值（已行空白值校正）和稀释倍数得到样品的最终蛋白浓度。取20μL蛋白样品加入5×loading Buffer 5μL，混匀，100℃加热10min，12000r/min离心5min，吸取上清行SDSPAGE。配制120g/L分离胶，60g/L浓缩胶；将蛋白Marker和蛋白样品分别加入上样孔，根据测得的蛋白样品的浓度调整各样品的上样量（每个泳道上样20μg）；以浓缩胶120V，分离胶160V，进行电泳，待溴酚蓝到达电泳槽底部（时间大约为90min）时，切断电源。电泳结束后，取出凝胶，电转移至硝酸纤维素膜（NC膜）；将NC膜移入1×丽春红液体里染色1min；观察转移效果后，标记蛋白Marker；水漂洗后，用TBST缓冲液漂洗NC膜至丽春红不见；50g/L脱脂奶粉（TBST缓冲液配制）封闭1h；将NC膜与一抗共同孵育1h，其中一抗用TBST缓冲液按1∶500稀释；用TBST缓冲液漂洗NC膜10min×3次；将NC膜与辣根过氧化物酶酶标记的第二抗体（用TBST缓冲液预先按1∶3000稀释该抗体）共同孵育1h；用TBST缓冲液漂洗NC膜10min×3次；于暗室用Ecl发光系统进行发光。用Glyko Bandscan 8.0软件对感光胶片蛋白条带进行灰度值分析，以目的条带与βactin内参照条带的比值代表蛋白的表达水平。每一条带代表3次重复实验的结果。
1.2.4 RTPCR 根据文献，分别合成PDGFB和PDGFRβ引物：PDGFB（217 bp）：上游引物：5GAAGGAGCCTGGGTTCCCTG 3下游引物： 5TTTCTCACCTGGACAGGTCG3；PDGFRβ（688bp）：上游引物：5AATGTCTCCAGCACCTTCGT 3，下游引物：5AGCGGATGTGGTAAGGCATA3 。冰上收集培养细胞（每份样品约2.5×106个细胞），弃上清，0.01mol/L PBS清洗，每份样品加入TRIzol提取液1mL，反复吹打将细胞悬浮后，移入1.5mL离心管中；用1mL注射器反复抽提5～10次，室温静置5min；加入氯仿200μL，充分混匀，室温静置15min，4℃离心，12000r/min×15 min；离心后液体呈三层（上层为无色水相层，约占60％，中间相为白色，底层为红色有机相层），将上层液体小心移入新的1.5mL离心管中；加异丙醇500μL，混匀，20℃静置10min，4℃离心，12000r/min×10min；弃上清，加750mL/L乙醇（DEPC水配制）1mL，充分混匀，4℃离心，12000r/min×15min；弃上清，风干，见管底有白色沉淀即为所得总RNA；加DEPC水20μL溶解总RNA，70℃保存；取适量总RNA稀释至100μL，测定260nm及280nm处A值。总RNA浓度（μg/mL）＝A260×40×稀释倍数；A260/A280接近2.0者认为纯度较好；取总RNA 1μg，在25μL反应体系中，以Oligo(dT)15为引物，应用AMV逆转录酶合成cDNA。取逆转录产物1μL为模板，在PCR扩增反应体系25μL中先将模板于94℃变性5min（热启动过程），加入Taq DNA聚合酶，在PE 2400 PCR热循环仪中完成各片段相应次数的循环。环在72℃延伸7min。PDGFRβ循环参数：94℃，30s；58℃，40 s；72℃，1min；循环30次，最后一个循环在72℃延伸7min。PCR反应结束后，PCR扩增产物行15g/L琼脂糖凝胶电泳。采用DL2000作为分子质量标准，将产物同预计的大小进行比较，所得结果拍照并扫描。成像后利用计算机图像分析软件分别读取各片段灰度值。为检验RNA的质量和RTPCR反应过程，实验设立空白对照和GAPDH对照, PCR反应体系和循环参数不变。以样品的灰度值与同一样品GAPDH的灰度值之比作为评价 mRNA表达量的指标，用t检验来检测组间的差异。P<0.05为具有显著性差异。
统计学处理：用Glyko Bandscan 8.0对结果进行灰度值分析。
2结果
2.1免疫组化和免疫荧光 常规剂量TNFα 作用于人视网膜微血管内皮细胞， 1h后，与对照组相比，细胞的PDGFB的DAB染色与免疫荧光显色均未出现荧光强弱的明显改变；在4h可见细胞的荧光强度稍有加强，刺激8h及12h后，PDGFB表达显著增强（灰度值:8h,90.3±6.0；对照组133.6±8.0,P<0.01；）；人视网膜微血管周细胞,与对照组相比，PDGFRβ的表达未出现明显变化。大剂量TNFα：作用于人视网膜微血管内皮细胞，4h后，与对照组相比，细胞的PDGFB的DAB染色与免疫荧光显色已经出现细胞的荧光强度的轻微减弱；刺激8h及12h后，PDGFB表达显著减弱（灰度值为:4h，136.4±5.0；8h，160.8±3.0；12h，154.2±6.0；对照组128.6±3.0，P<0.01，图1）。人视网膜微血管周细胞，与对照组相比，PDGFRβ的表达在8，12h已经可见荧光强度的显著变化（灰度值为：8h，143.3±2.0；对照组110.9±9.0，P<0.01）。
2.2 Western blot分析 在βactin条带比较一致的条件下，用Glyko Bandscan 8.0对感光胶片蛋白条带进行灰度值分析，以目的条带与内参照条带的比值代表蛋白的表达水平。TNFα常规剂量组： PDGFB的蛋白表达水平分别为4h，1.12；8h，1.53；12h，1.67；24h，1.10； PDGFRβ的蛋白表达水平分别为4h，1.13；8h，1.09；12h，1.15；24h，1.18。TNFα大规剂量组：PDGFB的蛋白表达水平分别为4h，0.78；8h，0.84；12h，0.45；24h，1.05； PDGFRβ的蛋白表达水平分别为4h，0.87；8h，0.72；12h，0.43；24h，1.05。
2.3 RTPCR半定量分析 常规TNFα剂量时，PDGFB的表达上调；表达在4h开始升高，在12h达到1.7倍；对于人视网膜微血管周细胞，暴露于常规剂量的TNFα，与对照组相比，PDGFRβ表达并未出现显著改变。当人视网膜微血管内皮细胞暴露于前期实验所选的大剂量TNFα时，PDGFB出现戏剧性的下调，8h表达开始出现下调，在12h PDGFB的表达量为原来的39％；对于人视网膜微血管周细胞，当暴露于大剂量TNFα时，在12h PDGFRβ表达为原来的45％。
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