【摘要】 目的：研究早产儿视网膜病变新生血管形成过程中VEGF对TGFβ表达的影响。 方法：体外培养人视网膜血管内皮细胞(HRCECs),分别转染重组腺相关VEGF病毒和VEGF的RNA干扰质粒到HRCECs，增高和抑制VEGF的表达，通过二氯化钴诱导HRCECs缺氧，观察TGFβ在不同VEGF水平下的mRNA表达变化，同时观察HRCECs增殖的变化。结果：高表达ＶＥＧＦ组(C组),低表达VEGF组(D组) ,阴性对照组(E组) ,阳性对照组(F组)的VEGF/actin分别为: 1.15±0.77, 0.36±0.31, 0.28±0.16, 0.83±0.72;而TGFβ/actin为: 0.55±0.39,0.92±0.57,0.18±0.07,0.70±0.45,当VEGF高表达，TGFβ的mRNA表达下调；在VEGF低表达时，TGFβ的mRNA表达上调。 结论：TGFβ能部分代偿VEGF的功能，视网膜新生血管形成过程中生长因子具有冗余性。
【关键词】 早产儿视网膜病变 新生血管 VEGF TGFβ 冗余性
0引言
早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, ROP)是一种严重的致盲性眼病,发生于未成熟或低体重出生婴儿的视网膜,新生血管的出现是ROP的主要特征,在新生血管发生发展的过程中,一系列生长因子参与其中[13],如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),血管生成因子1,胰岛素样生长因子,碱性成纤维生长因子,转化生长因子β（transforming growth factor β,TGFβ)等，这些因子都具有促进新生血管形成的作用,其中VEGF起到中心和关键的作用[4],有关这些因子单个的作用机制研究很多,而对这些生长因子之间的作用研究甚少,这样很难从整体水平认识新生血管的发生机制,因此,本文拟以VEGF为切入点,探索缺氧状态下视网膜血管内皮细胞（human retinal capillary endothelial cells,HRCECs）的VEGF表达发生变化时,TGFβ的表达改变,为下一步的研究奠定基础。 表1 VEGF和TGFβ在缺氧状态下的表达(n=6)
高表达VEGF组（C组）低表达VEGF组（D组）阴性对照组（E组）阳性对照组（F组）VEGF/actin1.15±0.770.36±0.310.28±0.160.83±0.72TGFβ/actin0.55±0.390.92±0.570.18±0.070.70±0.45
1材料和方法
1材料 细胞培养试剂：20g/L胰酶(Sigma公司，美国)，0.66g/L II型胶原酶(Gibco公司,美国)，胎牛血清(四季青公司，中国)，DMEM培养液(Gibco公司，美国)，纤维连接蛋白(Invitrogen公司，美国)，内皮细胞培养液(Gibco公司,美国)，胰岛素转铁蛋白硒添加物ITS(Gibco公司,美国),内皮细胞生长因子ECGF(Sigma公司,美国)，第Ⅷ因子相关抗原抗体（DAKO公司,美国）。新鲜人眼球取自本科手术室角膜移植术后的废弃眼球（术前均具备由本院伦理委员会批准的患者知情同意书）。生化试剂和仪器：Hot star Taq Polymerase试剂盒(Qiagen公司,德国)；SYBR Green I荧光染料(ABI公司,美国); Trizol Reagent Kit RNA提取试剂盒（基因公司，中国香港）；ABI7300 Real time PCR仪（ABI公司,美国）；流式细胞仪FACSCAN, Beckman 公司，美国）。重组腺相关病毒2VEGF（rAAV2VEGF）病毒和VEGF的RNA干扰pSIRENVEGF质粒由本实验室提供。
1.2方法
1.2.1 HRCECs的培养 参见文献进行[5]角膜移植术后的废弃眼球，无菌下剪开眼球，取视网膜神经层，胰酶室温消化视网膜15min，再用0.66g/L型胶原酶消化30min，加入200mL/L胎牛血清的DMEM培养液终止消化，离心收集细胞，人内皮细胞培养液培养，培养瓶涂纤维连接蛋白，待细胞汇合单细胞层后，按1∶2传代，第VIII因子相关抗原抗体鉴定内皮细胞。
1.2.2转染rAAVVEGF重组腺病毒和RNAiVEGF到HRCECs 取3～6代的HRCECs进行实验，传代到六孔板内，分为A、B、C、D 4个组，每组6孔, C组转染rAAVVEGF重组腺相关病毒, D组转染pSIRENVEGF质粒,A和B组分别转染空白rAAV和pSIREN质粒作为对照组。
1.2.3 RTPCR检测4组细胞VEGF的表达 转染48h 后用QIAGEN 的RNA 提取试剂盒提取4组细胞的mRNA,用RT 试剂盒将mRNA 反转录为cDNA,以βactin 为内对照作PCR ,βactin引物为: 上游5’CTGGGTATGGAATCCTGTGG3’,下游 5’ TCATCGTACTCCTGCTTGCTG3’;VEGF引物为: 上游5’TCT TCAAGCCGTCCTGTGTG3’, 下游5’ACAGTGAACGCTCCAGGATTT A3’。反应条件为 94℃,30s ,63℃ 30s ,72℃ 1min,31个循环,20g/L的琼脂糖凝胶电泳,拍照,JVC KyF30B 3CCD 彩色图像摄录输入仪作图像分析,对比分析不同组VEGF的mRNA表达改变。
1.2.4诱导转染的HRCECs缺氧 取C组（rAAVVEGF转染组），D组（pSIRENVEGF组）细胞植入6孔板，每组6孔,培养液中加入50μmol/L 二氯化钴诱导缺氧状态，同时另设E、F两组对照:正常HRCECs植入6孔板，每组6孔进行实验, E组细胞未用二氯化钴处理作为阴性对照,F组用二氯化钴处理作为阳性对照。
1.2.5实时定量PCR检测C、D、E、F组TGFβ的mRNA的表达变化 实验方法参见上述，TGFβ的引物为：上游5’ATTCCTGGCGATACCTCAG 3’，5’CGGTAGTGAACCCGTT
图1 VEGF在人视网膜血管内皮细胞的表达 A和B组分别转染空白rAAV和pSIREN质粒作为对照组, C组转染rAAVVEGF病毒, D组转染RNAi pSIRENVEGF质粒
图2 VEGF在各组的表达改变 A和B组VEGF的mRNA表达差异无显著性，同这两组比较，C组VEGF的mRNA表达增高，D组表达降低，并且差异有显著性
GAT 3’，退火温度为52℃，内参引物与上述相同，实时收集FAM/Sybr荧光信号，经过31个循环后72℃保温10min，然后进行融解曲线的分析,对比分析bFGF的mRNA表达变化。
1.2.6流式细胞术检测C、D、E、F组细胞增殖变化 每组取6孔HRCECs，胰酶消化，收集细胞，调整密度为106，700mL/L冷酒精固定细胞，加入RNA酶，PI染色，流式细胞仪检测细胞生长周期。
统计学处理：运用SAS 6.12统计学软件，对转染组与对照组内皮细胞VEGF和TGFβ的表达、以及HECECs增殖等实验数据进行方差分析和q检验，以P＜0.05为有统计学意义。
2结果
2.1 rAAVVEGF重组腺病毒和RNAiVEGF成功转染到内皮细胞 半定量PCR结果显示：A、B两组VEGF的mRNA表达差异无显著性，同这两组比较，C组VEGF的mRNA表达增高，D组表达降低，并且差异有显著性；说明C组成功高表达VEGF，D组成功抑制VEGF的表达，可以用于下一步研究（图1，2）。
2.2缺氧状态下HRCECs的VEGF表达变化对TGFβ表达的影响 C组（VEGF高表达组）、D组（RNAiVEGF组）、E组（阴性对照组）、F组（阳性对照组）VEGF和TGFβ的mRNA表达，可以发现：E组两者的mRNA表达都低，而F组两者的mRNA表达都增高，同E组比较，C、D两组的VEGF和TGFβ表达都增高；同F组比较，C组的VEGF显著增高而TGFβ表达降低；D组的VEGF表达降低时TGFβ显著增高，差异有显著性(图3,表1)。
2.3缺氧状态下HRCECs的VEGF表达变化对细胞增殖的影响 C组、D组、E组、F组在G1期细胞分别为（20.08±2.63）%、（34.35±3.51）%、（58.77±4.85）%、（28.10±3.37）%，C组、D组、F组同E组比较,差异有显著性(P＜0.05）。而C组、D组、F组比较,差异也有显著性,说明VEGF对细胞增殖具有重要作用。
图3 VEGF不同表达时TGFβ的表达变化 VEGF显著增高则TGFβ表达降低，VEGF表达降低时TGFβ显著增高，差异有显著性
[1] [2] 下一页 |
